Leishmania infantum infection in dogs: from diagnosis to immunotherapy and prevention

Abstract

La leishmaniosis canina (CanL) causada pel protozoo Leishmania infantum es considera una zoonosis important a Europa i el seu control i prevenció és un dels principals objectius tant de les agències de salut pública com dels veterinaris. El desenvolupament de la leishmaniosi clínica està molt influenciat per la resposta immunitària de l’hoste. L’ús d’immunoteràpia per millorar la resposta immunitària específica enfront Leishmania s’ha explorat en gossos amb resultats positius. Tanmateix, encara hi ha dubtes sobre l’eficàcia de la immunoteràpia en l’àmbit clínic, tant en la prevenció com en el tractament de la CanL. La CanL sovint requereix un enfocament integrat degut a la seva complexitat i variabilitat. Es disposa de diverses tècniques de diagnòstic per detectar la infecció per L. infantum que solen realitzar-se utilitzant diferents tipus de mostres com ara sang i sèrum. L’ús de mostres alternatives és prometedor i podria millorar la prevenció i el control de la malaltia. La primera hipòtesi d’aquesta tesi doctoral va ser que l’ús actual de la immunoteràpia i altres mesures preventives per prevenir la infecció per L. infantum en gossos que viuen en regions d’alta endèmia ha augmentat en l’última dècada. La segona hipòtesi era que l’ús sol de la immunoteràpia també podria evitar el desenvolupament de malaltia clínica en gossos sans i Leishmania seropositius. Finalment, la detecció precoç de la infecció per L. infantum és molt important per controlar i prevenir la malaltia. Es disposa de diverses tècniques de diagnòstic, normalment realitzades amb sang, sèrum, orina i altres teixits infectats. Tanmateix, també s’ha investigat l’ús de mostres alternatives amb resultats prometedors. Els objectius generals d’aquesta tesi doctoral eren: 1) investigar l’ús d’eines de cribratge serològic i mesures preventives contra la infecció per L. infantum en gossos de països europeus amb endèmia de Leishmania, 2) investigar i validar noves tècniques de diagnòstic per a la detecció precoç i el seguiment de la infecció per L. infantum i la resposta immunitària en gossos en l’àmbit clínic i 3) avaluar l’eficàcia i la seguretat de Leisguard® com a immunoterapèutic per a gossos sans i Leishmania seropositius per evitar el desenvolupament de malaltia clínica. En aquesta tesi doctoral es descriu l’ús d’eines de cribratge serològic i mesures preventives contra la infecció per L. infantum en gossos d’Espanya (capítol 3). A més, en el capítol 4 es descriu la taxa de seroprevalència actual de L. infantum en gossos aparentment sans que viuen a Espanya. Al capítol 5, es va desenvolupar un ELISA in-house per a la detecció d’anticossos específics contra L. infantum en transsudat oral. També es va realitzar un estudi de l’efecte de l’emmagatzematge en la prova de reducció de nitroblau de tetrazoli en mostres de sang de gos amb resultats positius (capítol 6). El capítol 7 és un estudi descriptiu de les característiques i l’estat serològic de gossos sans i Leishmania seropositius, que són un grup clínicament negligit pel que fa al tractament de L. infantum. El capítol 8 és un assaig clínic multicèntric cec, aleatoritzat i controlat per avaluar l’eficàcia i la seguretat de Leisguard® com a tractament immunoterapèutic en gossos sans i Leishmania seropositius. En conclusió, aquesta tesi doctoral demostra la importància de la immunoteràpia en la infecció per L. infantum en gossos tant per a la prevenció de la infecció com per al tractament contra el desenvolupament de la malaltia en gossos sans i Leishmania seropositius. A més, també destaca la importància de les mesures preventives, les eines de cribratge i els controls anuals als països endèmics de L. infantum. Finalment, també s’ha subratllat el valor de les noves tècniques que es podrien realitzar rutinàriament en l’àmbit clínic.

La leishmaniosis canina (CanL) causada por Leishmania infantum se considera una zoonosis importante en Europa y su control y prevención es uno de los principales objetivos tanto de las agencias de salud pública como de los veterinarios. El desarrollo de la leishmaniosis clínica está muy influenciado por la respuesta inmunitaria del huésped. El uso de inmunoterapia para potenciar la respuesta inmunitaria frente a Leishmania se ha explorado en perros con resultados positivos. Sin embargo, aún existen dudas sobre la eficacia de los inmunoterapéuticos en el ámbito clínico, tanto en la prevención como en el tratamiento de la CanL. La CanL a menudo requiere un enfoque integrado debido a su complejidad y variabilidad. Hay varias técnicas de diagnóstico disponibles para detectar la infección por L. infantum que se realizan utilizando diferentes tipos de muestras, como sangre y suero. El uso de muestras alternativas es prometedor y podría mejorar la prevención y el control de la enfermedad. La primera hipótesis de esta tesis fue que el uso actual de inmunoterapia y otras medidas preventivas para prevenir la infección por L. infantum en perros que viven en regiones de alta endemia se ha incrementado en la última década. La segunda hipótesis era que el uso de inmunoterapia por sí sola también podría evitar el desarrollo de la enfermedad clínica en perros sanos y seropositivos para Leishmania. Finalmente, la detección temprana de la infección por L. infantum es importante para controlar y prevenir la enfermedad. Existen varias técnicas de diagnóstico, generalmente realizadas con sangre, suero, orina y otros tejidos infectados. Sin embargo, se ha investigado el uso de muestras alternativas con resultados prometedores. Los objetivos generales de esta tesis doctoral fueron: 1) investigar el uso de herramientas de cribado serológico y medidas preventivas frente a la infección por L. infantum en perros de países con Leishmania endémica, 2) investigar y validar nuevas técnicas de diagnóstico para la detección y seguimiento de la infección por L. infantum y la respuesta inmunitaria en perros en el entorno clínico y 3) evaluar la eficacia y seguridad de Leisguard® como inmunoterapéutico para perros sanos y seropositivos a Leishmania para evitar el desarrollo de la enfermedad clínica. En esta tesis doctoral se describe el uso herramientas de cribado serológico y medidas preventivas contra la infección por L. infantum en perros de España (capítulo 3). Además, en el capítulo 4 se describe la tasa de seroprevalencia actual de L. infantum en perros aparentemente sanos que viven en España. En el capítulo 5, se describe un ELISA in-house para la detección de anticuerpos específicos frente a L. infantum en trasudado oral. También se detalla un estudio del efecto del almacenamiento en la prueba de reducción de nitro azul de tetrazolio en muestras de sangre de perros (capítulo 6). El capítulo 7 es un estudio descriptivo de las características y estado serológico de perros sanos y seropositivos a Leishmania, que son un grupo clínicamente desatendido en cuanto al tratamiento de L. infantum. El capítulo 8 es un ensayo clínico multicéntrico, controlado, aleatorizado y ciego para evaluar la eficacia y la seguridad de Leisguard® como tratamiento inmunoterapéutico en perros sanos y seropositivos a Leishmania. En conclusión, esta tesis doctoral demuestra la importancia de la inmunoterapia en la infección por L. infantum en perros para su prevención y tratamiento contra el desarrollo de la enfermedad en perros sanos y seropositivos a Leishmania. También destaca la importancia de las medidas preventivas, las herramientas de detección y los controles anuales en los países endémicos de L. infantum. Finalmente, también subraya el valor de nuevas técnicas que podrían realizarse de forma rutinaria en el entorno clínico.

Canine leishmaniosis (CanL) caused by the protozoan Leishmania infantum is considered a major zoonosis in Europe and its control and prevention is one of the main objectives of both public health agencies and veterinarians. The development of clinical leishmaniosis is closely influenced by the immune response of the host. The use of immunotherapy to enhance the specific immune response against Leishmania has been explored in dogs with positive results. However, there are still doubts about the effectiveness of immunotherapeutics in the clinical field, both in the prevention and treatment of CanL. CanL often requires an integrated approach due to its complexity and variability. Several diagnostic techniques are available to detect L. infantum infection and are usually performed using different types of samples such as blood and serum. The use of alternative samples is promising and could improve the prevention and control of the disease. The first hypothesis of this doctoral thesis was that the current use of immunotherapy and other preventive measures to prevent L. infantum infection in dogs living in high endemic regions has increased in the last decade. The second hypothesis was that the use of immunotherapy alone could also avoid the development of clinical illness in Leishmania-seropositive healthy dogs. Finally, early detection of L. infantum infection is highly important to control and prevent the disease. Several diagnostic techniques, usually performed with blood, serum, urine and other infected tissues, are available. However, the use of alternative samples has also been investigated with promising results. The general objectives of this doctoral thesis were: 1) to investigate the use of serological screening tools and preventive measures against L. infantum infection in dogs from European Leishmania-endemic countries, 2) to investigate and validate new diagnostic techniques for the early detection and follow-up of L. infantum infection and immune response in dogs in the clinical setting and 3) to evaluate the efficacy and safety of Leisguard® as an immunotherapeutic for Leishmania-seropositive healthy dogs to avoid the development of clinical illness. In this doctoral thesis, the use of serological screening tools and preventive measures in L. infantum infection in dogs from Spain is described (chapter 3). Moreover, chapter 4 described the current seroprevalence rate for L. infantum in apparently healthy dogs that live in Spain. In chapter 5, an in-house ELISA for the detection of specific antibodies against L. infantum in oral transudate was developed. A study of the effect of storage on nitro blue tetrazolium (NBT) reduction test in dog blood samples was also performed with positive results (chapter 6). Chapter 7 is a descriptive study of the signalment and serological status of Leishmania-seropositive healthy dogs, which are a clinically neglected group regarding treatment of L. infantum. Chapter 8 is a blinded, randomized and controlled multicentre clinical trial to assess the efficacy and safety of Leisguard® as an immunotherapeutic treatment in Leishmania-seropositive healthy dogs. In conclusion, this doctoral thesis demonstrated the importance of immunotherapy in L. infantum infection in dogs for both the prevention of the infection and the treatment against disease development in Leishmania-seropositive healthy dogs. Furthermore, the significance of preventive measures, screening tools and annual check-ups in L. infantum-endemic countries was also highlighted. Finally, the value of new techniques that could be performed routinely in the clinical setting was also underlined.