Administration of chitosan-tripolyphosphate-DNA nanoparticles overexpressing key enzymes to improve omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acid synthesis in gilthead sea bream (Sparus aurata)

Abstract

[eng] Eicosapentaenoic acid (20:5n-3, EPA) and docosahexaenoic acid (22:6n-3, DHA) are omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids (n-3 LC-PUFA) known to prevent atherosclerosis, stroke, obesity, type-2 diabetes, inflammation and autoimmune disease, among others. Few organisms, such as Caenorhabditis elegans and some invertebrates, can synthesize the n-3 fatty acid series in significant amounts, and marine fish and shellfish, which acquire pre-formed LC-PUFA by trophic transfer, are the major sources of n-3 LC-PUFA in the human diet. However, substitution of fish oil by vegetable oils in aquafeeds reduces healthy n-3 LC-PUFA in cultured fish, while increases proinflammatory n-6 fatty acids. The present study aimed to empower Sparus aurata to boost endogenous synthesis of n-3 LC-PUFA by transient expression of fish codon-optimized Caenorhabditis elegans Δ12/n-6 (FAT-2) and Δ15/n-3 (FAT-1) fatty acid desaturases using chitosan-tripolyphosphate (TPP) nanoparticles as DNA delivery system. Growth performance, body composition, serum metabolites, fatty acid profile and expression of key enzymes in intermediary metabolism were evaluated in Sparus aurata juveniles 72 hours after a single intraperitoneal injection of chitosan-TPP nanoparticles encapsulated with expression plasmids encoding fish codon-optimized C. elegans FAT-1 and FAT-2 (short-term effect) and in 70-day treated fish that were periodically administered with chitosan-TPP-DNA nanoparticles (long- term sustained effect). For the short-term study, increased levels of FAT-1 and FAT-2 mRNAs (> 10-fold) were detected 72 hours post-injection in the S. aurata liver. Expression of FAT-1 elevated hepatic EPA and total n-3 PUFA. In addition to reduced serum triglycerides, co-expression of FAT-1 and FAT-2 also induced proportions of DHA and PUFA in the S. aurata liver. Compared to control fish, treatment with FAT-1, FAT-2 and FAT-1 + FAT-2 downregulated expression of hepatic key genes in glycolysis and lipogenesis, including g6pd, pfk1, pk, pfkfb1, acaca, acacb, fasn, scd1a and fads2. In addition, co-expression of FAT-1 and FAT-2 significantly upregulated the activity of rate-limiting enzymes in glycolysis and the pentose phosphate pathway. Fish expressing FAT-2 and FAT-1 + FAT-2 showed lower hepatic expression of pparg and srebf1, and higher of hnf4a. Treatment with FAT-1 and FAT-2 alone downregulated srebf1 and upregulated ppara, respectively, in the S. aurata liver. To study long-term sustained expression of FAT-1, FAT-2 and FAT-1 + FAT-2, chitosan-TPP-DNA nanoparticles were provided to fish every 4 weeks (3 doses in total). After 70 days of treatment, tissue distribution analysis showed high expression levels for FAT-1 and FAT-2 in the liver (>200-fold) followed by the intestine (10 to 25-fold), while no differential expression occurred in the skeletal muscle and brain. Expression of FAT-1 and FAT-1 + FAT-2 increased weight gain. Fatty acid methyl esters assay revealed that co-expression of FAT-1 and FAT-2 increased liver production and muscle accumulation of EPA, DHA and total n-3 LC-PUFA, while decreased the n-6/n-3 ratio. Co-expression of FAT-1 and FAT-2 downregulated srebf1 and genes encoding rate-limiting enzymes for de novo lipogenesis in the liver, leading to decreased circulating triglycerides and cholesterol. In contrast, FAT-2 and FAT-1 + FAT-2 upregulated hepatic hnf4a, nr1h3 and key enzymes in glycolysis and the pentose phosphate pathway. Our findings demonstrate that administration of chitosan-TPP-DNA nanoparticles, a methodology that circumvents obtention of genetically modified organisms, is a proper gene delivery method for sustained expression of exogenous enzymes in the liver of Sparus aurata. Specifically, co-expression of FAT-1 and FAT-2 enabled the production of functional fish for human consumption, rich in n-3 LC-PUFA, notably EPA and DHA, and with decreased n-6/n-3 fatty acids ratio. In addition, co- expression of FAT-1 and FAT-2 increased weight gain and the specific growth rate in Sparus aurata.

[spa] Los ácidos eicosapentaenoico (20:5n-3, EPA) y docosahexaenoico (22:6n-3, DHA) son ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga omega-3 (n-3 LC-PUFA) conocidos por prevenir aterosclerosis, accidentes cerebrovasculares, obesidad, diabetes tipo 2, inflamación y enfermedades autoinmunes, entre otras. Algunos organismos, como Caenorhabditis elegans y ciertos invertebrados, pueden sintetizar n-3 LC-PUFA en cantidades significativas. Peces y mariscos marinos adquieren LC-PUFA preformados por transferencia trófica y son las principales fuentes de n-3 LC-PUFA en la dieta humana. Sin embargo, la sustitución de aceite de pescado por aceites vegetales en piensos acuícolas reduce el contenido de n-3 LC-PUFA saludables en peces cultivados, mientras que aumenta la proporción de ácidos grasos n-6 proinflamatorios. El objetivo de esta tesis ha sido promover la biosíntesis de n-3 LC-PUFA en dorada (Sparus aurata) mediante la administración de nanopartículas de quitosano-tripolifosfato (TPP)-DNA para expresar transitoriamente las desaturasas de ácidos grasos Δ12/n-6 (FAT-2) y Δ15/n-3 (FAT- 1) de Caenorhabditis elegans. Se evaluó el efecto sobre el crecimiento, composición corporal, metabolitos séricos, perfil de ácidos grasos y expresión de enzimas clave en el metabolismo intermediario en juveniles de S. aurata 72 horas después de una dosis intraperitoneal de nanopartículas de quitosano-TPP encapsuladas con plásmidos de expresión de FAT-1 y FAT-2 de C. elegans con codones optimizados para peces (efecto a corto plazo) y en peces administrados periódicamente con nanopartículas de quitosano-TPP-DNA durante 70 días (efecto sostenido a largo plazo). A corto plazo, 72 horas tras la administración de las nanopartículas, los niveles de mRNA de FAT-1 y FAT-2 se incrementaron en hígado de S. aurata (> 10 veces). La expresión de FAT-1 incrementó EPA y n-3 PUFA total en hígado. La coexpresión de FAT-1 y FAT-2 redujo los triglicéridos séricos e incrementó las proporciones de DHA y PUFA hepáticas. En comparación con peces control, el tratamiento con FAT-1, FAT-2 y FAT-1 + FAT-2 disminuyó la expresión de genes hepáticos clave en glucólisis y lipogénesis, como g6pd, pfkl, pklr, pfkfb1, acaca, acacb, fasn, scd1a y fads2. Además, la coexpresión de FAT-1 y FAT-2 aumentó significativamente la actividad de enzimas clave en glucólisis y vía de las pentosas fosfato. FAT-2 y FAT-1 + FAT-2 disminuyeron la expresión hepática de pparg y srebf1, e incrementaron hnf4a. El tratamiento con FAT-1 disminuyó srebf1 mientras que FAT-2 incrementó ppara en hígado de S. aurata. La expresión sostenida de FAT-1, FAT-2 y FAT-1 + FAT-2 a largo plazo se estudió en peces tratados con nanopartículas de quitosano-TPP-DNA cada 4 semanas (3 dosis en total). Tras 70 días, el análisis de la distribución tisular mostró niveles elevados de expresión de FAT-1 y FAT-2 en hígado (>200 veces) e intestino (10-25 veces), no hallándose expresión diferencial en músculo esqueleto ni cerebro. La expresión de FAT-1 y FAT-1 + FAT-2 incrementó la tasa de crecimiento. El ensayo de ésteres metílicos de ácidos grasos reveló que la coexpresión de FAT-1 y FAT-2 incrementó la producción hepática y acumulación muscular de EPA, DHA y n-3 LC-PUFA total, disminuyendo la relación n-6/n-3. La coexpresión de FAT-1 y FAT-2 disminuyó la expresión de srebf1 y enzimas clave en lipogénesis de novo hepática, causando una disminución de triglicéridos y colesterol circulantes. Por el contrario, FAT-2 y FAT-1 + FAT-2 incrementaron la expresión de hnf4a, nr1h3 y enzimas clave en glucólisis y ruta de las pentosas fosfato. Nuestros resultados muestran que las nanopartículas de quitosano-TPP-DNA promueven la expresión sostenida de enzimas exógenas en hígado de S. aurata, evitando la generación de organismos modificados genéticamente. Específicamente, la coexpresión de FAT-1 y FAT-2 permite producir pescado funcional para consumo rico en n-3 LC-PUFA, particularmente EPA y DHA, y con baja relación n-6/n-3. Además, la coexpresión de FAT-1 y FAT-2 incrementó la talla y la tasa de crecimiento específico en S. aurata.