Molecular Basis of Ischemic Post-Conditioning: DJ-1 in Cardioprotection

Abstract

Les malalties cardiovasculars són la principal causa de morbimortalitat a tot el món, essent l’infart agut de miocardi (IAM) la més prevalent. Encara que la revascularització és el tractament definitiu per a la isquèmia, paradoxalment comporta el potencial d’exacerbar el dany en un procés conegut com a lesió per isquèmia/reperfusió (I/R). El cor humà adult conserva una capacitat regenerativa mínima. Per tant, després d’un IAM es diposita una cicatriu no contràctil, disminuint el rendiment cardíac. Encara que la millora de les teràpies de revascularització ha permès disminuir la mortalitat, els supervivents d’IAM amb lesió miocàrdica tenen un alt risc de desenvolupar insuficiència cardíaca. El descobriment del fenomen de condicionament, referit a la cardioprotecció adquirida després de l’aplicació de cicles alterns i breus d’isquèmia i reperfusió, ha revelat l’existència de programes cardioprotectors endògens. No obstant, s’han obtingut resultats decebedors en estudis clínics, assenyalant llacunes en la comprensió de les bases molecular de la cardioprotecció. Primerament, explorem el programa cardioprotector desencadenat pel postcondicionament isquèmic (PostCo) en model porcí. Per a això analitzem el proteoma mitocondrial del miocardi en isquèmia, I/R i PostCo, mitjançant xarxes d’interacció proteïna-proteïna. Identifiquem el metabolisme cardíac i la inducció de DJ-1 com a actors importants en cardioprotecció. DJ-1 és una proteïna multifuncional implicada en la supervivència cel·lular en estrès, la funció molecular i regulació de la qual encara no s’han entès per complet. Proposem que la seva regulació proporcionaria una nova oportunitat terapèutica per a protegir el miocardi. Posteriorment, caracteritzem la dinàmica de DJ-1 en isquèmia i I/R. Usant un model in vitro, trobem que DJ-1 és escindit i secretat per cèl·lules endotelials (CEs) en isquèmia, i evidenciem un paper regulant l’activitat de l’ATP-sintasa ectòpica. Mentre la isquèmia va conduir a l’augment de gairebé 3 vegades en la generació d’ATP extracelul·lar, el silenciament de DJ-1 va anul·lar l’efecte. L’ATP-sintasa ectòpica es troba a la membrana plasmàtica de molts tipus cel·lulars i participa en la regulació del pH intracel·lular i senyalització purinèrgica, entre altres. Usant DJ-1 recombinant, vam poder associar la seva presència extracelul·lar amb la regulació de la funció de CEs en reperfusió. Per a explorar el potencial terapèutic de l’administració de DJ-1 recombinant, vam emprar un model murí d’IAM. L’administració intraperitoneal de DJ-1 recombinant abans de la inducció de l’IAM va reduir significativament la grandària de l’infart i va modificar el transcriptoma. Conjunts de gens associats amb la resposta immunitària i senyalització via receptors acoblats a proteïna G (RAPGs) es van detectar després de l’IAM en presència del tractament. Si bé la resposta immunitària és un actor conegut de la lesió per I/R, la senyalització per RAPGs participa en cardioprotecció. També, detectem la disminució de la infiltració leucocitària, estrès oxidatiu i apoptosi en el miocardi dels animals tractats. Finalment, estudiem les implicacions funcionals de la capacitat de DJ-1 d’unir ARN en I/R. Amb aquesta finalitat, analitzem un conjunt de dades resultants de la identificació dels transcrits que uneix DJ-1 i descobrim la unió preferencial a transcrits codificades pel mitocondri. A més, la unió d’ARN a DJ-1 augmenta notablement en isquèmia, contribuint a l’estabilitat mitocondrial. Si bé la depleció de DJ-1 va resultar en un increment de l’expressió de proteïnes mitocondrials en normòxia, aquesta va caure significativament després d’I/R. De la mateixa manera, la depleció de DJ-1 va resultar en un reticle mitocondrial híper fusionat i sensible a I/R. En conclusió, les nostres troballes destaquen la implicació de DJ-1 en les bases moleculars de la cardioprotecció. Proporcionem les primeres línies d’evidència respecte l’activitat extracelul·lar de DJ-1 i caracteritzem un aspecte addicional implicat en el manteniment de l’estabilitat mitocondrial.

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de morbimortalidad en todo el mundo, siendo el infarto agudo de miocardio (IAM) la más prevalente. Aunque la revascularización es el tratamiento definitivo para la isquemia, paradójicamente conlleva el potencial de exacerbar el daño en un proceso conocido como lesión por isquemia/reperfusión (I/R). El corazón humano adulto conserva una capacidad regenerativa mínima. Por tanto, tras un IAM se deposita una cicatriz no contráctil, disminuyendo el gasto cardíaco. Aunque la mejora de las terapias de revascularización ha permitido disminuir la mortalidad, los supervivientes de IAM con lesión miocárdica tienen un alto riesgo de desarrollar insuficiencia cardíaca. El descubrimiento del fenómeno de condicionamiento, referido a la cardioprotección adquirida tras la aplicación de ciclos alternos y breves de isquemia y reperfusión, ha revelado la existencia de programas cardioprotectores endógenos. Sin embargo, se han obtenido resultados decepcionantes en estudios clínicos, señalado lagunas en la comprensión de las bases molecular de la cardioprotección. En primer lugar, exploramos el programa cardioprotector desencadenado por el poscondicionamiento isquémico (PostCo) en modelo porcino. Para ello analizamos el proteoma mitocondrial del miocardio en isquemia, I/R y PostCo, mediante redes de interacción proteína-proteína. Identificamos el metabolismo cardíaco y la inducción de DJ-1 como actores importantes en cardioprotección. DJ-1 es una proteína multifuncional implicada en la supervivencia celular bajo estrés, cuya función molecular y regulación aún no se han entendido por completo. Hipotetizamos que su regulación proporcionaría una nueva oportunidad terapéutica para proteger al miocardio. Posteriormente, caracterizamos la dinámica de DJ-1 en isquemia e I/R. Usando un modelo in vitro, encontramos que DJ-1 es escindido y secretado por células endoteliales (CEs) en isquemia, y evidenciamos un papel regulando la actividad de la ATP-sintasa ectópica. Mientras la isquemia condujo a un aumento de casi 3 veces en la generación de ATP extracelular, el silenciamiento de DJ-1 anuló el efecto. La ATP-sintasa ectópica se encuentra en la membrana plasmática de muchos tipos celulares y participa en la regulación del pH intracelular y señalización purinérgica, entre otros. Usando DJ-1 recombinante, pudimos asociar su presencia extracelular con la regulación de la función de CEs en reperfusión. Para explorar el potencial terapéutico de la administración de DJ-1 recombinante, empleamos un modelo murino de IAM. Como resultado, la administración intraperitoneal de DJ-1 recombinante antes de la inducción del IAM redujo significativamente el tamaño del infarto y modificó el transcriptoma. Varios conjuntos de genes asociados con la respuesta inmunitaria y señalización vía receptores acoplados a proteína G (RAPGs) abarcaron los mayores enriquecimientos después del IAM en presencia del tratamiento. Si bien la respuesta inmunitaria es un actor conocido de la lesión por I/R, la señalización por RAPGs participa en cardioprotección. Además, detectamos la disminución de la infiltración leucocitaria, estrés oxidativo y apoptosis en el miocardio de los animales tratados. Finalmente, estudiamos las implicaciones funcionales de la capacidad de DJ-1 de unir ARN en I/R. Con ese fin, analizamos un conjunto de datos resultantes de la identificación de los transcritos que une DJ-1 y descubrimos la unión preferencial a transcritos codificadas por la mitocondria. Además, la unión de ARN a DJ-1 aumenta notablemente en isquemia, contribuyendo a la estabilidad mitocondrial. Si bien la depleción de DJ-1 resultó en un incremento de la expresión de proteínas mitocondriales en normoxia, esta cayó significativamente tras I/R. Del mismo modo, la depleción de DJ-1 resultó en un retículo mitocondrial hiperfusionado y sensible a I/R. En conclusión, nuestros hallazgos destacan la implicación de DJ-1 en las bases moleculares de la cardioprotección. Proporcionamos las primeras líneas de evidencia con respecto a una actividad extracelular para DJ-1 y caracterizamos un aspecto adicional implicado en el mantenimiento de la estabilidad mitocondrial.

Cardiovascular diseases are a leading cause of mortality and morbidity worldwide. Among them, acute myocardial infarction (AMI) is the most prevalent. Although revascularization is the definitive treatment for ischemia, it paradoxically entails the potential to exacerbate damage in a process known as ischemia/reperfusion (I/R) injury. The adult human heart retains minimal regenerative capacity. Therefore, after AMI, a non-contractile scar is formed decreasing cardiac output. Although the improvement of revascularization therapies has driven a drop in mortality within the past decades, AMI survivors with myocardial injury are at high risk of developing heart failure. The discovery of the conditioning phenomena, referring to the acquired cardioprotection derived from the application of repetitive brief cycles of ischemia and reperfusion, has evidenced the existence of endogenous cardioprotective programs. However, disappointing results have been obtained in clinical studies, highlighting gaps in the understanding of the molecular basis of cardioprotection. We first explored the endogenous cardioprotective program triggered by ischemic post-conditioning (IPostC) in a swine model. To this end, we analyzed the mitochondrial proteomic response of the myocardium to ischemia, I/R, and IPostC, following a protein-protein interaction network approach. We identified both cardiac metabolism, and the up-regulation of DJ-1 as important drivers for cardioprotection. DJ-1 is a multifunctional protein playing intriguing roles in cell survival under stress. Although it has been a matter of intense research, the function and regulation of DJ-1 remain to be fully understood. We hypothesized that its regulation would provide a new therapeutic opportunity for myocardium salvage. Then, we characterized the dynamics of DJ-1 over ischemia and I/R. Using an in vitro model, we found that DJ-1 is cleaved and secreted by endothelial cells (ECs) during ischemia, and evidenced a role in regulating the ectopic ATP-synthase activity. Whilst ischemia led to a nearly 3-fold increase in the extracellular ATP generation, the knockdown of DJ-1 abrogated the effect. The ectopic ATP-synthase is located within the plasma membrane and it has been recognized to participate in the regulation of intracellular pH, and purinergic signaling, amongst others. Using a recombinant DJ-1 model, we could further associate extracellular DJ-1 with the regulation of ECs function after reperfusion. To test the therapeutic potential of recombinant DJ-1 administration, we employed a mouse model of AMI. As a result, the intraperitoneal administration of recombinant DJ-1 before AMI significantly reduced infarct size and modified the myocardium transcriptional response to reperfusion. Interestingly, gene sets associated with the immune response and G-protein coupled receptors (GPCRs) signaling encompassed the highest enrichments after AMI in the presence of the treatment. Whilst the immune response is a known player of I/R injury, GPCRs signaling has been extensively reported to participate in cardioprotection. Diminished leukocyte infiltration, oxidative stress, and apoptosis were also detected in the myocardium of the treated animals. To further characterize the role of DJ-1 in I/R, we studied the functional implications of the previously reported RNA-binding activity of DJ-1. To this end, we analyzed a dataset resulting from the identification of DJ-1-binding transcripts and found that DJ-1 preferentially binds mitochondria-encoded transcripts and that RNA-binding to DJ-1 significantly increases during ischemia. The impact of DJ-1 depletion and I/R on mitochondrial protein expression and mitochondrial morphology was also investigated. While mitochondrial protein levels were found higher for the DJ-1 knockout cultures in normoxia, they significantly fell after I/R. Consistently, DJ-1 depletion resulted in unstable hyper-fused mitochondria, that were sensitive to I/R. In conclusion, our findings highlight the implication of DJ-1 in the molecular basis of cardioprotection. We further provide the first lines of evidence regarding an extracellular activity for DJ-1 and characterize an additional aspect of DJ-1 maintaining mitochondrial stability.