Enginyeria genètica i metabòlica de la microalga Chlamydomonas reinhardtii per la producció sostenible de glicolípids bioactius

Abstract

Els glicolípids són una gran família de molècules amfifíliques amb una part polar formada per una o més unitats de sucre i una part apolar lipídica. Aquests compostos estructurals mostren un gran interès industrial i farmacològic gràcies a les seves propietats tant físiques com biològiques. Existeixen diverses aplicacions com per exemple en la farmacèutica, cosmètica, o com a biosurfactants i adjuvants de fàrmacs, entre d’altres.

Tot i existir un gran interès en aquests compostos, la seva utilització en la indústria biotecnològica es veu limitada per la seva producció i obtenció. La síntesis química presenta moltes dificultats i etapes de protecció i desprotecció degut la necessitat d’obtenir la regioespecificitat d’aquestes molècules. Una altra alternativa possible és l’obtenció mitjançant síntesis enzimàtica, però l’alt cost d’alguns dels substrats lipídics o sucres activats fan incrementar el cost total del procés. Així que una tercera estratègia que apareix com a prometedora és l’enginyeria metabòlica de plataformes cel·lulars que, un cop transformades amb els enzims necessaris per la síntesis d’aquests compostos, proporcionin les eines moleculars i els metabòlits necessaris per sintetitzar i obtenir el producte desitjat.

Com a organisme hoste per incorporar els enzims per efectuar aquestes enginyeries metabòliques és proposa la microalga verda unicel·lular Chlamydomonas reinhardtii. Aquesta microalga presenta una àmplia bateria d’eines moleculars, el seu genoma seqüenciat i metodologies de transformació tant del genoma nuclear com del genoma del cloroplast. Apart, es presenta com una microalga segura (GRAS) i per tant amb un gran potencial biotecnològic. Al consistir en un organisme fotosintètic pot transformar el diòxid de carboni en el nostre compost d’interès, gràcies a la llum solar, obtenint així el nostre compost d’una forma més sostenible amb una petjada de carboni menor. És per tot això que les microalgues ja s’utilitzen actualment per produir proteïnes recombinants d’interès, en la indústria de la alimentació, creació de biopolímers o bioplàstics, font de biocombustibles i fins i tot bioremediació.

En aquest projecte de tesis s’hi van realitzar dues estratègies per tal de produir dos glicolípids amb valor afegit, com són els glicoglicerolípids i els ramnolípids, i explorar, alhora, dues estratègies d’enginyeria: transformació del genoma nuclear i transformació del genoma del cloroplast de Chlamydomonas reinhardtii.

En la primera estratègia es pretén expressar de forma heteròloga la glicosiltransferasa de Mycoplasma genitalium MG517 que catalitza l’enllaç glicosídic d’una glucosa o galactosa a una unitat lipídica de diacilglicerol. L’expressió de la MG517 pretenia obtenir un nou reservori de glicoglicerolípids (presents de forma endògena en els tilacoides del cloroplast de C.reinhardtii) en el compartiment del citosol/reticle endoplasmàtic. A més a més aquesta nova glicosiltransferasa a l’hoste C.reinhardtii aportaria biodiversitat als glicoglicerolípids, ja que aquesta microalga tant sols presenta galactosildiacilglicerols amb unes cadenes lipídiques concretes (provinents de la ruta procariota del cloroplast) i al incorporar la MG517 es vol crear també glicosildiacilglicerols amb diferents cadenes lipídiques, presents en el reticle endoplasmàtic. S’explora, doncs, la transformació nuclear del genoma de Chlamydomonas reinhardtii mitjançant electroporació i agitació amb “glass beads” i es realitzen estudis moleculars per cercar la proteïna recombinant i estudis del perfil lipídic de la microalga per tal d’analitzar-ne el producte. També es proven diferents soques recipients de l’enginyeria, s’introdueixen introns interespaiats a la seqüència codificant del gen, i es cerca una metodologia de rastreig massiu per tal de trobar línies candidates òptimes.Tot i els esforços bolcats en aquest apartat, es va aconseguir detectar la proteïna recombinant de l’enzim MG517 però la seva inestable expressió al llarg de les generacions impossibilitava l’estudi de la seva activitat, i aquesta problemàtica no va semblar desaparèixer amb el canvi de sistemes d’expressió ni amb la inserció d’introns al casset d’expressió. El sistemes de cribratge es van posar apunt però no van aconseguir detectar candidates per l’expressió de la proteïna de fusió mVenus+MG517.

Pel que fa la segona estratègia, es vol introduir, no tant sols un gen, sinó la ruta de síntesis de ramnolípids de Pseudomonas aeruginosa per així obtenir una plataforma cel·lular verda per la producció d’aquests biosurfactants amb alt interès comercial. Es van introduir els gens rhlA (cadena A de ramnosiltransferasa) que dona l’enzim RhlA, que catalitza la formació d’HAA (àcid 3-(3-hidroxialcanoiloxi)alcanoat), i el gen rhlB (cadena B de ramnosiltransferasa) que produeix mono-ramnolípids per la unió de ramnosa en el compost lipídic d’HAA. Per aquest objectiu es selecciona el cloroplast com a diana, degut a la presencia del substrat de l’enzim RhlA, 3-hidroxiacil-ACP, en el cicle de síntesis dels àcids grassos i per explorar un alternativa a l’expressió de proteïnes per la via nuclear. Es pretén, en un inici, expressar tant sols el primer enzim, RhlA i analitzar la seva expressió i activitat mitjançant la detecció del seu producte lipídic HAA. Posteriorment es volen introduir els següents gens de la síntesi dels ramnolípids com és el cas de la ramnosiltransferasa RhlB i analitzar també la seva presència i la seva activitat detectant el producte de mono-ramnolípid. Es va arribar a detectar l’expressió de l’enzim RhlA i el seu producte HAA presentant diversitat de congèneres, essent el HAA (C10-C10) i HAA(C10-C8) els més abundants. Per el que fa l’expressió de RhlB no es va poder arribar a detectar la proteïna tot i que si que estudis preliminars detecten el producte de síntesis de l’enzim RhlB, el mono-ramnolípid.

Totes dues estratègies obren portes de noves metodologies al laboratori i creen noves proves de concepte sobre aquesta microalga verda, que es planteja com una possible plataforma cel·lular per la producció de glicolípids amb valor afegit.

Los glicolípidos son una gran familia de moléculas anfifílicas con una parte polar formada por una o más unidades de azúcar y una parte apolar lipídica. Estos compuestos estructurales muestran un gran interés industrial y farmacológico gracias a sus propiedades tanto físicas como biológicas. Existen diversas aplicaciones como por ejemplo en la farmacéutica, cosmética, o como biosurfactantes y adyuvantes de fármacos, entre otros.

Aunque existe un gran interés en estos compuestos, su utilización en la industria biotecnológica se ve limitada por su producción y obtención. La síntesis química presenta muchas dificultades y etapas de protección y desprotección debido a la necesidad de obtener la regioespecificidad. Otra alternativa posible es la obtención mediante síntesis enzimática, pero el alto coste de algunos de los sustratos lipídicos o azúcares activados incrementan el coste total del proceso. Así que una tercera estrategia que aparece como prometedora es la ingeniería metabólica de plataformas celulares que, una vez transformadas con las enzimas necesarias por la síntesis de estos compuestos, proporcionen las herramientas moleculares y los metabolitos necesarios para sintetizar y obtener el producto deseado.

Como organismo huésped para incorporar las enzimas para efectuar estas ingenierías metabólicas se propone la microalga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii. Esta microalga presenta una batería de herramientas moleculares, un genoma secuenciado y metodologías de transformación tanto del genoma nuclear como del genoma del cloroplasto. Aparte, se presenta como una microalga segura (GRAS) y por tanto con un gran potencial biotecnológico. Al consistir en un organismo fotosintético puede transformar el dióxido de carbono atmosférico, gracias a la luz solar, en nuestro compuesto de interés, obteniendo así nuestro compuesto con una huella de carbono menor. Por todo ello, las microalgas ya se utilizan actualmente para producir proteínas recombinantes de interés, en la industria de la alimentación, creación de biopolímeros o bioplásticos, fuente de biocombustibles e incluso biorremediación.

En este proyecto de tesis se realizaron dos estrategias para producir dos glicolípidos con valor añadido, como son los glicoglicerolípidos y los ramnolípidos, y explorar, al mismo tiempo, dos estrategias de ingeniería: transformación del genoma nuclear y transformación del genoma del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii.

En la primera estrategia se pretende expresar de forma heteróloga la glicosiltransferasa de Mycoplasma genitalium MG517 que cataliza el enlace glicosídico de una glucosa o galactosa a una unidad lipídica de diacilglicerol. La expresión de la MG517 pretendía obtener un nuevo reservorio de glicoglicerolípidos (presentes de forma endógena en los tilacoides del cloroplasto de C.reinhardtii) en el compartimiento del citosol/retículo endoplasmático. Además esta nueva glicosiltransferasa al huésped de C.reinhardtii aportaría biodiversidad a los glicoglicerolípidos, ya que esta microalga sólo presenta galactosildiacilgliceroles con unas cadenas lipídicas concretas (provenientes de la ruta procariota del cloroplasto) y al incorporar la MG51 también glicosildiacilgliceroles con diferentes cadenas lipídicas, presentes en el retículo endoplasmático. Se explora, pues, la transformación nuclear del genoma de Chlamydomonas reinhardtii mediante electroporación y agitación con “glass beads” y se realizan estudios moleculares para buscar la proteína recombinante y estudios del perfil lipídico de la microalga para analizar su producto. También se prueban diferentes cepas recipientes de la ingeniería, se introducen intrones interespaciados en la secuencia codificante del gen, y se busca una metodología de rastreo masivo para encontrar líneas candidatas óptimas. A pesar de los esfuerzos volcados en este apartado, se logró detectar la proteína recombinante de la enzima MG517 pero su inestable expresión a lo largo de las generaciones imposibilitaba el estudio de su actividad, y esta problemática no pareció desaparecer con el cambio de sistemas de expresión ni con la inserción de intrones en el casete de expresión. Los sistemas de cribado se optimizaron, pero no lograron detectar candidatas por la expresión de la proteína de fusión mVenus+MG517.

En cuanto a la segunda estrategia, se quiere introducir, no sólo un gen, sino la ruta de síntesis de ramnolípidos de Pseudomonas aeruginosa para así obtener una plataforma celular verde para la producción de estos biosurfactantes con alto interés comercial. Se introdujeron los genes rhlA (cadena A de ramnosiltransferasa) que da enzima RhlA que cataliza la formación de HAA(ácido 3-(3-hidroxialcanoiloxi)alcanoato), y el gen rhlB (cadena B de ramnosiltransferasa) que produce mono- por la unión de ramnosa en el compuesto lipídico de HAA. Para este objetivo se selecciona el cloroplasto como diana, debido a la presencia del sustrato de la enzima RhlA, 3-hidroxiacilo-ACP, en el ciclo de síntesis de los ácidos grasos y para explorar una alternativa a la expresión de proteínas por la vía nuclear. Se pretende, en un inicio, expresar tan sólo la primera enzima, RhlA y analizar su expresión y actividad mediante la detección de su producto lipídico HAA. Posteriormente se quieren introducir los siguientes genes de la síntesis de los ramnolípidos como es el caso de la ramnosiltransferasa RhlB y analizar también su presencia y su actividad detectando el producto de mono-ramnolípido. Se llegó a detectar la expresión de la enzima RhlA y su producto HAA presentando diversidad de congéneres, siendo el HAA (C10-C10) y HAA(C10-C8) los más abundantes. En cuanto a la expresión de RhlB no se pudo llegar a detectar la proteína, aunque estudios preliminares detectan el producto de síntesis de la enzima RhlB, el mono-ramnolípido.

Ambas estrategias abren puertas de nuevas metodologías en el laboratorio y crean nuevas pruebas de concepto sobre esta microalga verde, que se plantea como una posible plataforma celular para la producción de glicolípidos con valor añadido.

Glycolipids are a large family of amphiphilic molecules with a polar part made up of one or more sugar units and a lipid nonpolar part. These structural compounds show great industrial and pharmacological interest thanks to their physical and biological properties. There are various applications such as pharmaceuticals, cosmetics, or as biosurfactants and drug adjuvants, among others.

Although there is great interest in these compounds, their use in the biotechnological industry is limited because of their production and obtention. Chemical synthesis presents many difficulties and protection and deprotection steps due to the need to obtain regiospecificity. Another possible alternative is to obtain it by enzymatic synthesis, but the high cost of some of the lipid substrates or activated sugars increase the total cost of the process. So, a third strategy that appears promising is the metabolic engineering of cellular platforms that, once transformed with the enzymes necessary for the synthesis of these compounds, provide the molecular tools and metabolites necessary to synthesize and obtain the desired product.

As a host organism to incorporate the enzymes to carry out these metabolic engineering, the unicellular green microalga Chlamydomonas reinhardtii is proposed. This microalga presents a battery of molecular tools, a sequenced genome, and transformation methodologies for both the nuclear genome and the chloroplast genome. Besides, it is presented as a safe microalgae (GRAS) and therefore with great biotechnological potential. As a photosynthetic organism, it can transform atmospheric carbon dioxide, thanks to sunlight, into our compound of interest, thus obtaining our compound with a lower carbon footprint. For all these reasons, microalgae are currently used to produce recombinant proteins of interest in the food industry, creation of biopolymers or bioplastics, a source of biofuels and even bioremediation.

In this thesis project, two strategies were carried out to produce two glycolipids with added value, such as glycoglycerolipids and rhamnolipids, and explore, at the same time, two engineering strategies: transformation of the nuclear genome and transformation of the Chlamydomonas reinhardtii chloroplast genome.

In the first strategy, the aim is to heterologously express the Mycoplasma genitalium MG517 glycosyltransferase that catalyzes the glycosidic bond of glucose or galactose to a diacylglycerol lipid unit. The expression of MG517 was intended to obtain a new reservoir of glycoglycerolipids (present endogenously in the thylakoids of the chloroplast of C.reinhardtii) in the cytosol/endoplasmic reticulum compartment. In addition, this new glycosyltransferase to the C.reinhardtii host would add biodiversity to the glycoglycerolipids, since this microalga only presents galactosyldiacylglycerols with specific lipid chains (from the prokaryotic chloroplast pathway) and by incorporating MG517 glycosyldiacylglycerols with different lipid chains, present in the endoplasmic reticulum, will be produced. Therefore, the nuclear transformation of the Chlamydomonas reinhardtii genome is explored by means of electroporation and agitation with "glass beads" and molecular studies are carried out to search for the recombinant protein and studies of the lipid profile of the microalgae to analyze its product. Different engineered recipient strains are also tested, interspaced introns are introduced into the gene coding sequence, and a mass screening methodology is sought to find optimal candidate lines. Despite the efforts invested in this section, it was possible to detect the recombinant protein of the MG517 enzyme, but its unstable expression throughout the generations made it impossible to study its activity, and this problem did not seem to disappear with the change in expression systems, nor with the insertion of introns into the expression cassette. The screening systems were optimized, but failed to detect candidates for the expression of the mVenus+MG517 fusion protein.

Regarding the second strategy, it was intended to introduce not only a gene, but also the Pseudomonas aeruginosa rhamnolipid synthesis pathway in order to obtain a green cellular platform for the production of these biosurfactants with high commercial interest. The genes rhlA (chain A of rhamnosyltransferase) were introduced, which produces the enzyme RhlA that catalyzes the formation of HAA (3-(3-hydroxyalkanoyloxy) alkanoate acid), and the gene rhlB (chain B of rhamnosyltransferase) that produces mono-rhamnolipid by the union of rhamnose in the lipid compound of HAA. For this purpose, the chloroplast is selected as a target, due to the presence of the RhlA enzyme substrate, 3-hydroxyacyl-ACP, and to explore an alternative way of protein expression apart nuclear transformation. Initially, it is intended to express only the first enzyme, RhlA, and to analyze its expression and activity by detecting its HAA lipid product. Subsequently, we want to introduce the following rhamnolipid synthesis genes, such as the RhlB rhamnosyltransferase, and analyze their presence and activity by detecting the mono-rhamnolipid product. It was possible to detect the expression of the RhlA enzyme and its HAA product, presenting diversity of congeners, with HAA (C10-C10) and HAA (C10-C8) being the most abundant. As far as the expression of RhlB is concerned, the protein could not be detected, although preliminary studies detect the synthesis product of the RhlB enzyme, the mono-rhamnolipid.

Both strategies open doors for new methodologies in the laboratory and provide proof of principle of the potential of this microalgae as a cellular platform for the production of added-value glycolipids.