Exploiting circulating lymphocytes and cell-free DNA as a source to develop minimally-invasive personalized T-cell therapies

Abstract

[eng] Adoptive cell transfer (ACT) of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can medi- ate tumor regression in patients with metastatic melanoma. Retrospective studies of TIL products from responders and non-responders have shown that successful TIL-ACT is associated with an expansion of T cells targeting neoantigens, which are derived from tumor-specific non-synonymous somatic mutations (NSMs) and present exquisite tumor specificity. In addition, ACT with TIL products enriched for neoantigen recognition has demonstrated antitumor activity in selected patients with epithelial tumors other than melanoma, which has fueled the interest in personalized T-cell therapies targeting neo- antigens. The identification and isolation of neoantigen-specific TILs has been possible due to advances in next-generation sequencing that enabled the rapid assessment of the tumor mutational landscape and the development of high-throughput personalized im- munological screenings. However, the need of a tumor biopsy to both identify candidate neoantigens and reactive T cells limits the broad applicability of personalized T-cell ther- apies targeting neoantigens and can underestimate tumor heterogeneity in the advanced metastatic setting. Previous reports have shown that neoantigen-specific T cells can be enriched from peripheral blood by selecting programmed death receptor-1 (PD-1)-ex- pressing lymphocytes in circulation. However, the frequency of neoantigen-specific T cells identified based on PD-1 expression remains very low and a tumor biopsy is still re- quired to identify candidate NSMs. In this thesis, we explored the use of peripheral blood as an alternative minimal- ly-invasive source to identify tumor NSMs and isolate neoantigen-specific or tumor-reac- tive T lymphocytes in patients with metastatic breast, gynecological, colorectal and head and neck cancer or chordoma. We performed whole-exome sequencing (WES) of cell-free DNA (cfDNA) to identify tumor NSMs and compared these to those identified in DNA ex- tracted from tumor biopsies (TuBx DNA). In parallel, we evaluated whether the selection of peripheral blood lymphocytes (PBLs) expressing a combination of cell-surface recep- tors, rather than the expression of PD-1 alone, could further enhance the frequency of neo- antigen-specific T cells and T-cell receptors (TCR) detected or the number of neoantigens recognized. Toidentifycirculating tumor antigen-specific T cells, wesorted CD8+ and CD4+ PBLs of ten patients with different types of epithelial cancers based on the expression of PD-1 into PD-1hi, PD-1dim and PD-1-, and in combination with the cell-surface receptors CD27,

CD38, CD39, HLA-DR and 4-1BB, obtaining up to 35 CD8+ and 35 CD4+ T-cell populations for some of the patients studied. In parallel, we also expanded TILs from tumor biopsies and compared the reactivities detected in the two T-cell sources. Ex vivo expanded PBL subsets and TILs were screened using a personalized high-throughput screening strategy, which enabled the detection of T cells targeting neoantigens identified by WES from TuBx DNA and cfDNA as well as T cells recognizing cancer germline antigens. Using this approach, we detected tumor antigen-specific T cells in eight out of 10 patients analyzed. Both CD8+ and CD4+ tumor antigen-reactive T cells were preferentially enriched in T-cell subsets expressing high levels of PD-1, either alone or in combination with other cell- surface markers, being PD-1hiCD39+ the combination of markers that more consistently identified CD4+ and CD8+ tumor reactivities. More importantly, the frequency of tumor antigen-specific T lymphocytes contained in the CD8+ PD-1hiCD39+ population was consistently higher than in any other CD8+ population sorted. This was not observed in CD4+ PBLs since the frequency of neoantigen-specific T cells was highly variable among PBL populations and none of them consistently displayed higher frequencies of neoantigen-reactive lymphocytes. The selection and expansion of CD8+ PD-1hiCD39+ PBLs outperformed the classical non-specific TIL expansion in high-dose interleukin-2 (IL-2) at identifying anti-tumor CD8+ T-cell responses. In contrast, despite the total number of CD4+ reactivities detected considering all populations screened from blood was higher than in TILs, the CD4+ PD-1hiCD39+ T-cell subpopulation identified fewer reactivities than unselected TILs. When comparing tumor and cfDNA, the overlap between NSMs identified in tumor and cfDNA varied notably between patients, with two out of six patients displaying no overlap between TuBx DNA and cfDNA WES. Moreover, WES of cfDNA from six patients preferentially identified clonal somatic mutations in tumor biopsies and enabled the identification of eight of 13 neoantigens in patients displaying some degree of overlap between tumor and cell-free NSMs. Our results underscore peripheral blood as an alternative source to identify cancer-specific neoantigens and CD8+ and CD4+ neoantigen- specific T lymphocytes and TCRs, with important implications for exploiting personalized T-cell responses in advanced cancer patients.

[cat] La teràpia adoptiva amb cèl·lules T infiltrants de tumor (TILs) ha demostrat capacitat de mediar regressió de lesions tumorals en pacients amb melanoma metastàtic. Estudis retrospectius dels productes cel·lulars utilitzats per tractar pacients que van respondre o no a la teràpia han demostrat que la resposta a la teràpia adoptiva amb TILs va associada a una major expansió de cèl·lules T amb capacitat de reconèixer neoantígens, els quals són pèptids que deriven de mutacions somàtiques no sinònimes (NSMs) específiques del tumor. A més, la teràpia adoptiva amb productes enriquits amb TILs específics contra neoantígens ha demostrat activitat antitumoral en pacients amb diferents tipus de tumors epitelials el que ha promogut l’interès en el desenvolupament de teràpies personalitzades amb limfòcits T reactius contra neoantígens. La identificació i aïllament de limfòcits T reactius contra neoantígens ha sigut possible gràcies als avenços en les tècniques de seqüenciació el que ha permès una ràpida avaluació del repertori mutacional del tumor així com el desenvolupament d’assajos personalitzats per testar el seu reconeixement. Tot i això, la necessitat d’accedir a una biòpsia tumoral tant per identificar els neoantígens candidats com per aïllar els limfòcits T ha limitat l’aplicabilitat de les teràpies personalitzades basades en cèl·lules T i a més a més, pot subestimar la heterogeneïtat tumoral en tumors metastàtics. Estudis previs han demostrat que els limfòcits T reactius contra neoantígens es poden identificar en sang perifèrica a través de la selecció de cèl·lules T amb expressió del receptor de mort programada tipus 1 (PD-1). Tanmateix, la freqüència de cèl·lules T reactives contra neoantígens després de seleccionar els limfòcits T que expressen PD-1 és molt baixa. A més, segueix sent necessària l'obtenció d'una biòpsia tumoral per tal de poder identificar les mutacions no sinònimes del tumor. En aquesta tesi doctoral hem explorat com a teràpia mínimament invasiva l’ús de sang perifèrica per identificar les NSMs del tumor i per aïllar els limfòcits T específics contra neoantígens o contra altres antígens tumorals en pacients amb càncer de mama, ginecològic, colorectal, de cap i coll o cordoma, tots en estat metastàtic. Per això, hem seqüenciat l’ADN circulant aïllat de la sang per tal d’identificar mutacions que puguin provenir del tumor i les hem comparat amb aquelles identificades en l’ADN extret de biòpsies tumorals dels mateixos pacients. Paral·lelament, hem seleccionat limfòcits de la sang perifèrica en base a l’expressió simultània de diversos receptors de superfície amb l’objectiu de veure si la co-expressió de receptors pot millorar la freqüència de cèl·lules T específiques contra neoantígens o bé incrementar el repertori de receptors de cèl·lules T (TCRs) reconeixent un mateix neoantigen comparat amb l’expressió exclusiva de PD-1.

Per tal d’identificar cèl·lules T reactives contra neoantígens en la sang perifèrica, vam separar per citometria de flux limfòcits CD8 i CD4 de deu pacients amb diferents tipus de tumors epitelials en base al nivell d’expressió de PD-1 en els grups: PD-1hi, PD- 1dim, PD-1- i en combinació amb altres receptors de superfície com CD27, CD39, CD38, HLA-DR i 4-1BB, obtenint fins a 35 poblacions diferents tant pels limfòcits CD8 com pels CD4 per alguns dels pacients inclosos en l’estudi. Paral·lelament, també vam expandir els TILs de les biòpsies tumorals d’aquests pacients i vam comparar els neoantígens o antígens tumorals reconeguts per aquestes dues fonts de limfòcits T. Les cèl·lules T de sang perifèrica o infiltrants de tumor es van expandir ex vivo i es van testar en assajos funcionals personalitzats el que ens va permetre detectar cèl·lules T amb capacitat de reconèixer neoantígens identificats per seqüenciació de l’exoma tant de l’ADN extret de biòpsies tumorals com de l’ADN circulant i antígens tumorals de línia germinal expressats en la biòpsia tumoral. Utilitzant aquesta aproximació, es van detectar cèl·lules T reactives contra neoantígens en vuit dels deu pacients estudiats. En la majoria dels casos, els limfòcits CD8 i CD4 reactius es van identificar en poblacions que expressaven alts nivells de PD-1 (PD-1hi), sol o en combinació amb altres marcadors, sent PD-1hiCD39+ la combinació que identificava limfòcits T reactius contra antígens tumorals de manera més consistent. A més, en els limfòcits CD8+, la població PD-1hiCD39+ sempre contenia la freqüència més elevada de limfòcits reactius en el cas que aquests s’haguessin identificat en diferents poblacions separades de la sang. Aquesta darrera observació no aplica pels limfòcits CD4+ ja que en aquest cas cap de les poblacions contenia la freqüència més alta de limfòcits T reactius contra neoantígens de manera consistent. La selecció i expansió de limfòcits CD8+ PD-1hiCD39+ de la sang perifèrica va permetre capturar un major nombre de reactivitats contra antígens tumorals que l’establert sistema d’expansió inespecífica de TILs en presència d’altes dosis d’interleuquina-2 (IL-2). Per altra banda, tot i que el nombre total de reactivitats identificades en les poblacions de limfòcits CD4+ aïllades de la sang perifèrica és superior a les identificades en els TILs, la combinació CD4+ PD- 1hiCD39+ identifica menys reactivitats que les detectades en els TILs. Pel que fa a les NSMs identificades en l’ADN tumoral i en l’ADN circulant, vam observar que el nombre de mutacions compartides entre les dues fonts d’ADN era altament variable, essent nul en dos dels sis pacients estudiats. La seqüenciació d’exoma de l’ADN circulant dels sis pacients va identificar preferencialment mutacions somàtiques clonals en les biòpsies tumorals. També va

permetre la identificació de vuit dels 13 neoantígens detectats en pacients que mostraven un cert grau de solapament entre les NSMs detectades en l’ADN extret de la biòpsia tumoral i l’ADN circulant. En resum, els nostres resultats demostren que l'ús exclusiu de sang perifèrica permet detectar neoantígens i els limfòcits CD4+ i CD8+ capaços de reconèixer aquest tipus d'antígens tumorals el que té implicacions importants pel desenvolupament de teràpies cel·lulars personalitzades en pacients amb tumors avançats.

[spa] En esta tesis, el objetivo principal era explorar la sangre periférica para poder identificar neoantígenos tumorales y los linfocitos capaces de reconocerlos. Para conseguir este objetivo, se realizó la secuenciación del exoma del ADN circulante extraído de muestras de plasma así como la secuenciación del ADN extraído de biopsias tumorales. Paralelamente, se seleccionaron diferentes poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ de la sangre en base a la expresión de ciertos marcadores de co-estimulación o inhibición y se testaron usando ensayos funcionales inmunológicos personalizados para ver su capacidad de reconocer neoantígenos y otros antígenos tumorales. Mediante estos análisis, se detectaron un total de 15 reactividades en la sangre, 8 CD8+ y 7 CD4+. En el caso de los CD8+, se observó que la población CD8+ PD-1hi CD39+ era la población que contenía más reactividades contra antígenos tumorales y que contenía la frecuencia más alta de linfocitos reactivos. En el caso de los CD4+, la población PD-1hiCD39+ también fue la población que identificó más reactividades aunque no detectó una proporción alta de reactividades indicando que esta puede no ser la mejor combinación de marcadores para CD4+. Por otro lado, la secuenciación del ADN circulante permitió identificar 8 de los 13 neoantígenos detectados en los 6 pacientes en los que se secuención el ADN circulante. Por tanto, estos resultados demuestran que es posible utilizar la sangre periférica para identificar neoantígenos y linfocitos específicos contra neoantígenos lo que puede permitir el desarrollo de terápias celulares personalizadas mínimamente invasivas únicamente utilitzando la sangre periférica.