Poly(ß-amino ester)-based nanocarriers for the co-delivery of siRNA and chemotherapeutic drugs

Abstract

La combinació de fàrmacs quimioterapèutics i ARN petit interferent (siRNA) representa una estratègia emergent per suprimir la resistència múltiple a fàrmacs (MDR) en el desenvolupament de tumors. En aquest estudi, s'han dissenyat i avaluat dos sistemes de coalliberament contra cèl·lules canceroses basats en poli(β-amino èster)s (pBAEs). Per construir aquests sistemes nanoparticulats, s’ha desenvolupat la síntesi d'un pBAE ortogonalment bifuncionalitzable que pot ésser modificat amb una àmplia gamma d’agents actius. Amb aquesta finalitat, s’ha construït un pBAE que conté grups azida en els extrems juntament amb cadenes laterals de piridil disulfur (PD) (pBAE-N3-PD). A més a més, s’han desenvolupat dos nous connectors heterobifuncionals per reaccionar amb les azides terminals del polímer mitjançant la cicloaddició d'azida-alquí promoguda per tensió anul·lar (SPAAC).

Aquesta estructura ortogonal s'ha utilitzat per a la preparació de sistemes d'alliberament de fàrmacs mitjançant l'ús de dues reaccions clic sense coure. En primer lloc, s’ha sintetitzat una nova estructura de pBAE-oligopèptid que conté doxorubicina (DOX) conjugada a través d'un enllaç sensible a dos estímuls (pH i glutatió). Aquest polímer funcionalitzat s'ha emprat per formar nanocomplexes estables amb siBCL-2 (pBAE-CR3-D/siBCL-2). Els assaigs in vitro d'alliberació de DOX han demostrat propietats significatives de resposta al pH i a l'ambient reductor, evitant la fuga dels fàrmacs durant la circulació i proporcionant una alliberació sostinguda en tumors. En les cèl·lules de càncer de pulmó resistents (GLC-4/ADR), les nanopartícules de pBAE-CR3-D/siBCL-2 disminueixen efectivament l'antiapoptosi, tant en els nivells d'expressió d'ARNm com de proteïnes BCL-2, sensibilitzant les cèl·lules canceroses a la DOX i millorant l'efecte terapèutic. En conseqüència, aquest treball proporciona una excel·lent plataforma per al coalliberament de fàrmacs i siRNA amb gran potencial per millorar el tractament del càncer amb MDR.

El pBAE ortogonal desenvolupat s'ha utilitzat també per construir un nanotransportador híbrid, basat en nanopartícules de sílice mesoporoses (MSN), per a l'administració combinada de siRNA i el fàrmac quimioterapèutic camptotecina (CPT). En aquest cas, el polímer pBAE-N3-PD s'ha conjugat a la MSN mitjançant un enllaç disulfur, i el lligant àcid fòlic (FA) s'ha conjugat als extrems terminals del polímer. Les nanopartícules també s'han carregat amb el profàrmac CPT unit covalentment a la superfície de la MSN mitjançant un enllaç disulfur (MSN-CPT-pBAE-FA). En condicions fisiològiques, les nanopartícules mostren una alliberació mínima de CPT, assegurant la protecció del fàrmac durant la circulació sanguínia. Per contra, en presència d'altes concentracions de glutatió, l’alliberació s’accelera significativament a causa de l'escissió de l'enllaç disulfur. Els resultats en cèl·lules tumorals pancreàtiques PANC-1 i MIA PaCa-2 mostren un comportament citotòxic superior i una internalització cel·lular facilitada amb l’ús de nanopartícules que contenen el lligant FA. En canvi, les cèl·lules HDF, deficients en receptors folats, mostren una internalització i toxicitat negligible enfront les nanopartícules amb FA. A més, la internalització és inhibida competitivament per la presència d'àcid fòlic lliure, el que suggereix que l’alliberació específica es produeix a través de l'endocitosi mediada pel receptor de folat. En conjunt, aquests resultats demostren que el sistema MSN-CPT-pBAE-FA constitueix un vector prometedor per al coalliberament de siRNA i fàrmacs.

La combinación de fármacos quimioterapéuticos y ARN interferente pequeño (siRNA) representa una estrategia emergente para suprimir la resistencia múltiple a fármacos (MDR) en el desarrollo de tumores. En este estudio, se han diseñado dos sistemas de coliberación basados en poli(β-amino éstere)s (pBAEs) y, posteriormente, se han evaluado contra células cancerosas. Para construir estos sistemas nanoparticulados, se ha desarrollado la síntesis de un pBAE ortogonalmente difuncionalizable que puede ser modificado con una amplia gama de agentes activos. Con este fin, se ha construido un pBAE que contiene grupos azida en los extremos junto con cadenas laterales de disulfuro de piridilo (PD) (pBAE-N3-PD). Además, se han diseñado dos conectores heterobifuncionales capaces de reaccionar con las azidas terminales del polímero a través de la cicloadición de azida-alquino promovida por tensión anular (SPAAC).

Esta estructura ortogonal se ha utilizado para la preparación de sistemas de liberación de fármacos mediante el uso de dos reacciones clic sin cobre. En primer lugar, se ha sintetizado una nueva estructura de pBAE-oligopéptido que contiene doxorrubicina (DOX) conjugada a través de un enlace sensible a dos estímulos (pH y glutatión). Este polímero funcionalizado se ha empleado para formar nanocomplejos estables con siBCL-2 (pBAE-CR3-D/siBCL-2). Los ensayos in vitro de liberación de DOX mostraron propiedades significativas de respuesta al pH y al ambiente reductivo, evitando la fuga del fármaco durante la circulación y proporcionando una liberación sostenida en tumores. En las células de cáncer de pulmón resistentes (GLC-4/ADR), las nanopartículas de pBAE-CR3-D/siBCL-2 disminuyeron efectivamente la antiapoptosis, tanto en los niveles de expresión de ARNm como de proteínas BCL-2, sensibilizando las células cancerosas a la DOX y mejorando el efecto terapéutico. En consecuencia, este trabajo proporciona una excelente plataforma para la coliberación de fármacos y siRNA con gran potencial para mejorar el tratamiento del cáncer con MDR.

El pBAE ortogonal desarrollado se ha utilizado también para construir un nanotransportador híbrido, basado en nanopartículas de sílice mesoporosa (MSN), para la administración combinada de siRNA y el fármaco quimioterapéutico camptotecina (CPT). En este caso, el polímero pBAE-N3-PD se ha conjugado a la MSN mediante un enlace disulfuro, y el ligando ácido fólico (FA) se ha conjugado a los extremos terminales del polímero. Las nanopartículas también se han cargado con el profármaco CPT unido covalentemente a la superficie de la MSN mediante un enlace disulfuro (MSN-CPT-pBAE-FA). En condiciones fisiológicas, las nanopartículas mostraron una liberación mínima de CPT, asegurando la protección del fármaco durante la circulación sanguínea. Por el contrario, en presencia de altas concentraciones de glutatión, la liberación se aceleró significativamente debido a la escisión del enlace disulfuro. Los resultados en células tumorales pancreáticas PANC-1 y MIA PaCa-2 mostraron un comportamiento citotóxico superior y una internalización celular facilitada por el uso de nanopartículas con el ligando FA. En cambio, las células HDF, deficientes en receptores folato, mostraron una internalización y toxicidad insignificantes frente a las nanopartículas con FA. Además, la internalización fue inhibida competitivamente por la presencia de ácido fólico libre, lo que sugiere que la liberación específica se produce a través de la endocitosis mediada por el receptor de folato. En conjunto, estos resultados demuestran que el sistema MSN-CPT-pBAE-FA constituye un vector prometedor para la coliberación de siRNA y fármacos.

Combination of chemotherapeutic drugs and small interfering RNA (siRNA) represents an emerging strategy to suppress multiple drug resistance (MDR) in tumor development. In this study, two co-delivery systems based on poly(β-amino ester)s (pBAEs) were designed and assessed against cancerous cells. To construct these nanoparticulate systems, it was disclosed the synthesis of an orthogonal pBAE which can be modified with a wide range of active moieties. To this end, a pBAE building block bearing azide moieties on the end-groups along with pyridyl disulfide (PD) side-chains was constructed (pBAE-N3-PD). Moreover, intended for further polymer functionalization, two heterobifunctional crosslinkers were developed to react with polymer azide-termini groups through strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

This orthogonally reactive scaffold was utilized for the preparation of tailored drug delivery systems via dual copper-free click reactions. Firstly, a novel pBAE-oligopeptide structure anchoring doxorubicin (DOX) through a dual-stimuli responsive linker (pH and glutathione) was synthesized and used to form stable polyplexes with siBCL-2. The in vitro release of DOX from pBAE-CR3-D/siBCL-2 nanoparticles displayed significant pH and redox responsive properties, preventing drug leakage during circulation and providing sustained drug release in tumors. In resistant lung cancer cells (GLC-4/ADR), pBAE-CR3-D/siBCL-2 effectively downregulated antiapoptosis at both BCL-2 mRNA and protein expression levels and hence sensitized the cancer cells to DOX improving the therapeutic effect. Consequently, this work provides a prospective platform to co-deliver drugs and siRNA to overcome MDR in cancer.

The developed orthogonal pBAE was further exploited to construct a mesoporous silica nanoparticle (MSN) hybrid pBAE nanocarrier for the co-delivery of siRNA and the chemotherapeutic drug camptothecin (CPT). Herein, pBAE-N3-PD was anchored to MSN through a disulfide bond, and the targeting ligand folic acid (FA) was conjugated to the polymer end-termini. The nanoparticles were also loaded with CPT prodrug covalently linked to MSN surface via disulfide bond (MSN-CPT-pBAE-FA). Under physiological conditions, nanoparticles displayed negligible CPT leakage, ensuring drug protection during blood circulation. By contrast, in the presence of high glutathione concentrations, release was significantly accelerated. Enhanced cytotoxic behavior and cellular internalization facilitated by the targeting group was observed against PANC-1 and MIA PaCa-2 pancreatic tumor cells. On the contrary, HDF cells, which are a FA receptor deficient cell line, exhibited negligible internalization and toxicity towards FA nanoparticles. Uptake was competitively inhibited by free folic acid, suggesting that the specific delivery is achieved through folate receptor-mediated endocytosis. Taken together, these results demonstrate that MSN-CPT-pBAE-FA provides a promising targeting carrier for siRNA and drug co-delivery.