Identification of novel genes expressed during mammalian spermatogenesis. Analysis of their functions and implication for fertility

Abstract

La meiosi és una divisió cel·lular especialitzada que genera gàmetes haploides durant la gametogènesi per a una reproducció exitosa. Errades durant la meiosi produeixen infertilitat en els mamífers. En humans, la infertilitat s'ha convertit en un problema de salut social important. Actualment es desconeixen moltes causes genètiques que originen la infertilitat en humans. Així, en aquest treball, vam voler identificar nous gens meiòtics necessaris per a la gametogènesi dels mamífers per a millorar el diagnòstic i la terapèutica de la infertilitat en humans. Aquest treball es basa en el descubriment de diversos transcrits no anotats detectats en testicles de ratolí de 14 dpp que vam predir que podien correspondre a nous gens. Per provar aquesta hipòtesi, vam realitzar una screen seqüencial resultant en la identificació de dos nous gens específics de la profase meiòtica Bend2 i Usp44. Després, vam caracteritzar la seva localització en meiòcits utilitzant anticossos policlonals i vam analitzar el fenotips dels ratolins mutants, centrant-nos en la fertilitat i els principals esdeveniments meiòtics (sinapsi i recombinació). D'una banda, BEND2 és una proteïna que conté el domini BEN, que està implicat en la regulació de la cromatina i la transcripció. BEND2 s'expressa des d'espermatogònies fins a l’estadi de paquitè primerenc durant l'espermatogènesi, independentment de la formació de dany al DNA o de la finalització de la recombinació. La supressió de BEND2 condueix a una pèrdua important de fol·licles primordials en femelles adultes i a una disminució de la fertilitat, però té efectes menors en l'espermatogènesi, malgrat mostrar un augment de l'apoptosi. Els meiòcits amb deficiència de BEND2 van mostrar una sinapsi normal tot i acumular H2AX a estadis de la profase tardans. També es va trobar un lleuger canvi del nombre de foci de RPA i RAD51 i una progressió meiòtica alterada en espermatòcits mutants per Bend2 i un nombre d’entrecreuaments reduït en oòcits mutants per Bend2. Aquests resultats indiquen que BEND2 és necessari per a la fertilitat femenina, però no per a la masculina. Tan mateix, la mutació de Bend2 comporta a una reparació alterada del dany en el DNA durant la profase meiòtica. D'altra banda, USP44 és un enzim deubiquitinant que es localitza en el complex sinaptonèmic durant la profase meiòtica, de manera dependent de SPO11 i DMC1. En absència d'USP44, la meiosi es va aturar a la majoria dels túbuls seminífers. Els espermatòcits presentaven alteracions en l'aparellament dels cromosomes homòlegs i en la sinapsi, els senyals de H2AX van persistir a les cèl·lules de zygotene-like amb acumulacions de foci de RPA i RAD51. Només una minoria d'espermatòcits van progressar a l'etapa de diplotè. Aquests resultats suggereixen que USP44 és essencial per a l'aparellament dels cromosomes homòlegs, la sinapsi i la reparació del DNA, així com per a la fertilitat masculina. En conclusió, els nostres resultats confirmen que la nostra aproximació metodològica és vàlida per identificar nous gens implicats en la gametogènesi dels mamífers. Amb aquesta estratègia, hem identificat amb èxit dos nous gens meiòtics essencials per a la fertilitat dels mamífers, proporcionant així nous coneixements que permeten millorar la nostra comprensió, el diagnòstic i el tractament de la infertilitat humana.

La meiosis es una división celular especializada que genera gametos haploides durante la gametogénesis para una reproducción exitosa. Errores durante la meiosis producen infertilidad en los mamíferos. En humanos, la infertilidad se ha convertido en un importante problema de salud social. Actualmente se desconocen muchas de las causas genéticas que originan la infertilidad en humanos. Así, en este trabajo, quisimos identificar nuevos genes meióticos necesarios para la gametogénesis de los mamíferos para mejorar el diagnóstico y la terapéutica de la infertilidad en humanos. Este trabajo se basa en el descubrimiento de varios transcritos no anotados detectados en testículos de ratón de 14 dpp que predijimos que podían corresponder a nuevos genes. Para probar esta hipótesis, realizamos una screen secuencial que resultó en la identificación de dos nuevos genes específicos de la profase meiótica Bend2 y Usp44. Después, caracterizamos su localización en meiocitos utilizando anticuerpos policlonales y analizamos el fenotipo de los ratones mutantes, centrándonos en la fertilidad y los principales eventos meióticos (sinapsis y recombinación). Por un lado, BEND2 es una proteína que contiene el dominio BEN, implicado en la regulación de la cromatina y la transcripción. BEND2 se expresa desde espermatogonias hasta el estadio de paquiteno temprano durante la espermatogénesis, independientemente de la formación de daño en el DNA o de la finalización de la recombinación. La supresión de BEND2 conduce a una importante pérdida de folículos primordiales en hembras adultas y a una disminución de la fertilidad, pero tiene efectos menores en la espermatogénesis, a pesar de mostrar un aumento de la apoptosis. Los meociitos con deficiencia de BEND2 mostraron una sinapsis normal a pesar de acumular H2AX en estadios de la profase tardíos. También se encontró un ligero cambio del número de foci de RPA y RAD51 y una progresión meiótica alterada en espermatocitos mutantes por Bend2 y un número de entrecruzamientos reducido en ovocitos mutantes por Bend2. Estos resultados indican que BEND2 es necesario para la fertilidad femenina pero no para la masculina. Asimismo, la mutación de Bend2 conlleva a una reparación alterada del daño en el DNA durante la profase meiótica. Por otra parte, USP44 es una enzima deubiquitinante que se localiza en el complejo sinaptonémico durante la profase meiótica, de forma dependiente de SPO11 y DMC1. En ausencia de USP44, la meiosis se detuvo en la mayoría de los túbulos seminíferos. Los espermatocitos presentaban alteraciones en el apareamiento de los cromosomas homólogos y en la sinapsis. Las señales de H2AX persistieron en las células de zygotene-like con acumulaciones de foci de RPA y RAD51. Sólo una minoría de espermatocitos progresaron hasta la etapa de diploteno. Estos resultados sugieren que USP44 es esencial para el apareamiento de los cromosomas homólogos, la sinapsis y la reparación del DNA, así como para la fertilidad masculina. En conclusión, nuestros resultados confirman que nuestra aproximación metodológica es válida para identificar nuevos genes implicados en la gametogénesis de los mamíferos. Con esta estrategia, hemos identificado con éxito dos nuevos genes meióticos esenciales para la fertilidad de los mamíferos, proporcionando nuevos conocimientos que permiten mejorar nuestra comprensión, el diagnóstico y el tratamiento de la infertilidad humana.

Meiosis is a specialized cell division, generating haploid gametes during gametogenesis for successful reproduction. Meiotic failure leads to infertility in mammals. In humans, infertility has become a major social health issue with many unknown genetic causes. Thus, in this work, we aimed to identify novel meiotic genes required for mammalian gametogenesis for better clinically relevant diagnosis and therapeutics. This work builds on the finding of several unannotated transcripts detected in 14 dpp mouse testis that we predicted to be novel genes. To test this hypothesis, we performed a sequential screen and eventually identified two novel meiotic prophase-specific genes Bend2 and Usp44. Then, we went through characterizing their localization in meiocytes using our in-house polyclonal antibodies and analyzing mutant mice focusing on fertility and meiotic major events (synapsis and recombination). On one hand, BEND2 is a BEN domain-containing protein likely involved in chromatin and transcriptional regulation. BEND2 is highly expressed in nuclei from spermatogonia until early pachytene during spermatogenesis, independently of either DSB formation or completion of recombination. The deletion of BEND2 leads to a significant loss of primordial follicles in adult females with reduced fertility but has minor effects on spermatogenesis, despite increased apoptosis. BEND2 deficient meiocytes exhibited normal synapsis and considerably increased H2AX during late prophase. A subtle change of RPA and RAD51 foci numbers and altered meiotic progression in Bend2 mutant spermatocytes and a reduced CO number in Bend2 mutant oocytes were also found. These results indicate BEND2 is required for female fertility but not male’s and the BEND2 mutation leads to insufficient DSB repair during prophase. On the other hand, USP44 is a deubiquitinating enzyme that localizes at synapsed chromosome axes during meiotic prophase, in a SPO11- and DMC1-dependent manner. In the absence of USP44, meiosis was arrested in most seminiferous tubules. Spermatocytes exhibited extensive defects in homolog pairing and synapsis, substantial H2AX signals persisted in zygotene-like cells with accumulations of RPA and RAD51 foci, and only a minority of spermatocytes progressed to the diplotene stage. These results suggest that USP44 is essential for homolog pairing, synapsis, and DSB repair as well as male fertility. In conclusion, our results confirm our approach is valid for identifying novel genes involved in mammalian gametogenesis. Using this strategy, we successfully identified two novel meiotic genes essential for mammalian fertility, thus providing new insights into understanding, diagnosing, and treating human infertility.