Structural and functional studies of Nse2, the SUMO E3 ligase of the SMC5/6 complex

Abstract

Les modificacions post-traduccionals (PTM) de les proteïnes mitjançant SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) són una forma de regulació de diferents funcions cel·lulars, com ara la transcripció o la reparació de l'ADN. SUMO pertany a la superfamília de proteïnes modificadores similars a la ubiquitina (UbL). Aquestes proteïnes estan formades per petits dominis proteics homòlegs, que s'uneixen a les proteïnes diana mitjançant la formació d'un enllaç isopeptídic entre els residus lisina del substrat i el C-terminal del modificador UbL. Aquesta reacció requereix la participació d'una cascada enzimàtica depenent de l'ATP formada pels enzims E1, E2 i E3. Els complexos de Manteniment Estructural dels Cromosomes (SMC, per les sigles en anglès) són heterodímers amb forma d'anell formats per dues proteïnes SMC i un nombre diferent de proteïnes satèl·lit. Els organismes eucariotes expressen tres complexos SMC: la cohesina, que manté les connexions entre les cromàtides germanes; la condensina, que compacta els cromosomes; i el Smc5/6, que promou la disjunció cromosòmica. Nse2 és una subunitat del complex Smc5/6 que posseeix activitat SUMO E3 lligasa a causa de la presència d'un domini SP-RING que activa el tioèster E2-SUMO per a passar-ho al substrat. En aquesta tesi, primer mostrem el disseny, la purificació del subcomplex i els primers intents de cristal·lització de construccions truncades del complex Smc5/6 humà. En segon lloc, demostrem la potenciació de l'activitat SUMO E3 lligasa de Nse2 després de la unió de l'ADN a una regió carregada positivament al domini arm de Smc5, revelant un mecanisme per restringir la SUMOilació a les proximitats d'aquelles molècules de Smc5/6-Nse2 unides a l'ADN. En tercer lloc, presentem l'estructura cristal·lina de Nse2/Smc5 en complex amb el tioèster carregat d'E2-SUMO, revelant els detalls estructurals d'aquesta interfície múltiple de proteïnes E2-E3. Finalment, descrivim el paper de dos motius similars a SIM (SUMO-Interacting Motif) a Nse2, que es reestructuren a l’unir-se al SUMO donant i al SUMO del costat de l’E2 durant la reacció de descàrrega dependent d'E3, revelant el mecanisme enzimàtic de la Nse2 SUMO E3 lligasa.

Las modificaciones postraduccionales (PTM) de las proteínas por medio de SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) son una forma de regulación de diferentes funciones celulares, como por ejemplo la transcripción o la reparación del ADN. SUMO pertenece a la superfamilia de proteínas modificadoras similares a la ubiquitina (UbL). Estas proteínas están formadas por pequeños dominios proteicos homólogos, que se unen a las proteínas diana mediante la formación de un enlace isopeptídico entre los residuos de lisina del sustrato y el C-terminal del modificador UbL. Esta reacción requiere la participación de una cascada enzimática dependiente de ATP compuesta por enzimas E1, E2 y E3. Los complejos de Mantenimiento Estructural de los Cromosomas (SMC, por sus siglas en inglés) son heterodímeros con forma de anillo formados por dos proteínas SMC y un número distinto de proteínas satélite. Los organismos eucariotas expresan tres complejos SMC: la cohesina, que mantiene las conexiones entre las cromátidas hermanas; la condensina, que compacta los cromosomas; y el Smc5/6, que promueve la disyunción cromosómica. Nse2 es una subunidad del complejo Smc5/6 que posee actividad SUMO E3 ligasa debido a la presencia de un dominio SP-RING que activa el tioéster E2-SUMO para su posterior descarga en el sustrato. En la presente tesis, primero mostramos el diseño, la purificación del subcomplejo y los primeros intentos de cristalización de construcciones truncadas del complejo Smc5/6 humano. En segundo lugar, demostramos la potenciación de la actividad SUMO E3 ligasa de Nse2 tras la unión del ADN a una región cargada positivamente en el dominio arm de Smc5, revelando un mecanismo para restringir la SUMOilación a las proximidades de aquellas moléculas de Smc5/6-Nse2 unidas al ADN. En tercer lugar, presentamos la estructura cristalina de Nse2/Smc5 en complejo con el tioéster cargado de E2-SUMO, revelando los detalles estructurales de esta interfaz múltiple de proteínas E2-E3. Finalmente, describimos el papel de dos motivos similares a SIM (SUMO-Interacting Motif) en Nse2, que se reestructuran al unirse al SUMO donante y al SUMO del lado de la E2 durante la reacción de descarga dependiente de E3, revelando el mecanismo enzimático de la Nse2 SUMO E3 ligasa.

Protein post-translational modification (PTM) by small ubiquitin-like modifier (SUMO) is a widespread manner of regulation of many cellular functions, including as example transcription or DNA damage repair. SUMO belongs to the ubiquitin-like modifiers (UbL) superfamily of proteins, which are constituted by homologous small protein domains that can be attached to protein targets by the formation of an isopeptidic bond between lysine residues in the substrate and the C-terminal tail of the UbL modifier. This reaction requires the participation of an ATP-dependent enzymatic cascade composed by an: E1, E2 and E3 enzymes. Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) complexes are ring-shaped heterodimers formed by two SMC proteins and a distinct number of satellite proteins. Eukaryotes contain three SMC complexes: cohesin, which maintains the connection between sister chromatids; condensin, which compacts chromosomes; and the Smc5/6 complex, which promotes chromosome disjunction, among other functions. Nse2 is a subunit of the Smc5/6 complex that possesses SUMO E3 ligase activity by the presence of a SP-RING domain that activates the E2~SUMO thioester discharge on the substrates. In the present thesis, we first show the design, subcomplex purification, and initial crystallization attempts of truncated constructs of the human Smc5/6 complex. Second, we reveal the enhancement of the SUMO E3 ligase activity of Nse2 upon DNA binding to a positively charged patch in the ARM domain of Smc5, revealing a potential mechanism to restrict SUMOylation to the vicinity of those Smc5/6-Nse2 molecules engaged on DNA. Third, we present the crystal structure of the Nse2/Smc5 in complex with the E2-SUMO charged thioester, disclosing the structural details of this multiple E2-E3 protein interface. We finally reveal the role of two SIM (SUMO-Interacting Motif)-like motifs in Nse2, which are restructured upon binding the donor and E2-backside SUMO during the E3-dependent discharge reaction, revealing the enzymatic mechanism of the Nse2 SUMO E3 ligase.