Insights into the functional role of Cytosolic Carboxypeptidases 1 and 6: from interactomics to cell biology

Abstract

S'hipotetitza que les proteases regulen gairebé totes les funcions biològiques, ja que representen un percentatge considerable del genoma humà. No obstant, poc se sap sobre les funcions biològiques de moltes. Això és especialment cert en el cas de les carboxipeptidases citosòliques, de les quals s'han suggerit funcions i implicacions, però sovint se'n desconeixen les veritables activitats biològiques i la implicació en processos cel·lulars complexos. Aquest treball de tesi doctoral tracta sobre la caracterització funcional de les carboxipeptidases citosòliques 1 i 6, dos enzims desglutamiladors membres de la subfamília M14D de metal·locarboxipeptidases que s'han relacionat amb processos cel·lulars rellevants com ara neurodegeneració i ciliopaties. Així doncs, la nostra recerca s'ha centrat específicament a determinar el paper funcional de les CCPs sota un punt de vista biomèdic, tractant de sorgir nous coneixements sobre la seva implicació en la salut i la malaltia. Amb aquest objectiu s’han realitzat estudis de biologia cel·lular, generació de knock out mitjançant CRISPR/Cas9, obtenció d’imatges d’alta resolució i avaluació de l’activitat enzimàtica. A més, s'ha desenvolupat i aplicat una tècnica proteòmica per a l'estudi del paisatge interactòmic d'aquestes carboxipeptidases. Aquest treball de tesi es compon de tres capítols interconnectats en què es caracteritzen funcionalment les carboxipeptidases citosòliques 1 i 6. En el primer capítol ens hem proposat la caracterització general de la CCP1 humana, el membre més gran de la família CCP, sent el que té el nombre més gran de dominis predits. L'elucidació dels papers funcionals específics a cada orgànul ha estat durant molt de temps un factor que ha contribuït significativament a l'estudi de les CCP. Per això, En aquest capítol ens hem centrat en com les cèl·lules es veuen afectades per la pèrdua d'activitat de CCP1. S'han determinat les consideracions generals de CCP1 quant al paper funcional utilitzant el knock out del gen, centrant-nos en les seves implicacions en els processos generals de desglutaminació, descrivint-ne la localització subcel·lular i el paper funcional nuclear específic. El segon capítol està destinat a la identificació dels paisatges interactòmics de CCP1 i CCP6 en humans sota un punt de vista biomèdic. Desvelar les interaccions proteïna-proteïna pot revelar com estan implicades en diferents processos, proporcionant pistes o ajudant a determinar la seva implicació en malalties. En aquest capítol s'han generat els paisatges interactòmics de CCP1 i CCP6 a partir de cèl·lules humanes in vitro, identificant nous interactors i substrats potencials que ens han permès conèixer el seu paper funcional. El treball proteòmic realitzat en aquest capítol es va dur a terme al Grup Bioscope (Universidade Nova de Lisboa, Portugal) dirigit pel professor José Luis Capelo sota la vigilància del Dr. Hugo Santos. En el darrer capítol ens vam proposar caracteritzar el ‘domini N’ conservat de les carboxipeptidases citosòliques, centrant-nos en CCP6 com a unitat mínima d'expressió de CCP. Aquest domini característic es conserva al llarg de la línia evolutiva, estant present a totes les CCPs identificades, però no en altres metal·locarboxipeptidases. Encara que s'ha realitzat un extens treball per descriure el domini catalític conservat, se sap poc sobre el ‘domini N’ i la seva implicació en l'activitat de les CCPs. Actualment, l'única informació relativa al ‘domini N’ s'ha obtingut de Caenorhabditis elegans. En aquest capítol, hem avaluat els efectes d’una mutació puntual en aquest domini sobre l’activitat enzimàtica de la CCP6 humana, alhora que avaluem les seves implicacions en l’estabilitat de la proteïna, la localització subcel·lular i l’especificitat de substrat. El treball experimental d'aquest capítol es va fer en col·laboració amb la Paula Alfonso.

Se hipotetiza que las proteasas regulan casi todas las funciones biológicas, ya que representan un porcentaje considerable del genoma humano. Sin embargo, poco se sabe sobre las funciones biológicas de muchas de ellas. Esto es especialmente cierto en el caso de las carboxipeptidasas citosólicas, de las que se han sugerido funciones e implicaciones, pero a menudo se desconocen sus verdaderas actividades biológicas y su implicación en procesos celulares complejos. El presente trabajo de tesis doctoral trata sobre la caracterización funcional de las carboxipeptidasas citosólicas 1 y 6, dos enzimas desglutamiladoras miembros de la subfamilia M14D de metalocarboxipeptidasas que se han relacionado con procesos celulares relevantes tales como neurodegeneración y ciliopatías. Así pues, nuestra investigación se ha centrado específicamente en determinar el papel funcional de las CCPs bajo un punto de vista biomédico, tratando de surgir nuevos conocimientos sobre su implicación en la salud y la enfermedad. Con este objetivo se han realizado estudios de biología celular, generación de knock out mediante CRISPR/Cas9, obtención de imágenes de alta resolución y evaluación de la actividad enzimática. Además, se ha desarrollado y aplicado una técnica proteómica para el estudio del paisaje interactómico de estas carboxipeptidasas. Este trabajo de tesis se compone de tres capítulos interconectados en los que se caracterizan funcionalmente las carboxipeptidasas citosólicas 1 y 6. En el primer capítulo nos hemos propuesto la caracterización general de la CCP1 humana, el miembro más grande de la familia CCP, siendo el que tiene el mayor número de dominios predichos. La elucidación de los papeles funcionales específicos en cada orgánulo ha sido durante mucho tiempo un factor que ha contribuido significativamente al estudio de las CCPs. Por ello, en este capítulo nos hemos centrado en cómo las células se ven afectadas por la pérdida de actividad de CCP1. Se han determinado las consideraciones generales de CCP1 en cuanto a su papel funcional utilizando el knock out del gen, centrándonos en sus implicaciones en los procesos generales de desglutaminación, describiendo su localización subcelular y su papel funcional nuclear específico. El segundo capítulo está destinado a la identificación de los paisajes interactómicos de CCP1 y CCP6 en humanos bajo un punto de vista biomédico. Desvelar las interacciones proteína-proteína puede revelar cómo éstas están implicadas en diferentes procesos, proporcionando pistas o ayudando a determinar su implicación en enfermedades. En este capítulo se han generado los paisajes interactómicos de CCP1 y CCP6 a partir de células humanas in vitro, identificando nuevos potenciales interactores y sustratos que nos han permitido conocer su papel funcional. El trabajo proteómico realizado en este capítulo se llevó a cabo en el Grupo Bioscope (Universidade Nova de Lisboa, Portugal) dirigido por el profesor José Luis Capelo bajo la vigilancia del Dr. Hugo Santos. En el último capítulo nos propusimos caracterizar el ‘dominio N’ conservado de las carboxipeptidasas citosólicas, centrándonos en CCP6 como unidad mínima de expresión de CCP. Este dominio característico se conserva a lo largo de la línea evolutiva, estando presente en todas las CCPs identificadas, pero no en otras metalocarboxipeptidasas. Aunque se ha realizado un extenso trabajo para describir el dominio catalítico conservado, se sabe poco sobre el ‘dominio N’ y su implicación en la actividad de las CCPs. En la actualidad, la única información relativa al ‘dominio N’ se ha obtenido de Caenorhabditis elegans. En este capítulo, hemos evaluado los efectos de una mutación puntual en este dominio sobre la actividad enzimática de la CCP6 humana, a la vez que evaluamos sus implicaciones en la estabilidad de la proteína, la localización subcelular y la especificidad del sustrato. El trabajo experimental de este capítulo se realizó en colaboración con Paula Alfonso.

Proteases are presumed to regulate nearly every biological function, as they represent a considerable percentage of the genome; nevertheless, little is known about the in vivo biological roles for many proteases. This is especially true for cytosolic carboxypeptidases, which have suggested functions and implications but are often unknown in terms of their true biological activities and implication in complex cellular processes. The present thesis work reports on the general functional characterisation of CCP1 and CCP6, two deglutamylating enzymes members of the M14D subfamily of metallocarboxypeptidases which have been related with relevant cellular processes. Thus, our research has specifically focused on determining the functional role of CCPs under a biomedical point of view, trying to arise new insights into their implication in health and disease. Cell biology studies, CRISPR/Cas9 knock out generation, high-resolution imaging, and enzymatic activity assessing were all carried out with this goal in mind. Furthermore, a proteomic technique was developed and applied for the study of the carboxypeptidase interactomic landscape. This thesis work is composed by three interconnected chapters were the cytosolic carboxypeptidases 1 and 6 are functionally characterized. In the first chapter we aimed for the general characterisation of human CCP1, first focusing on how cells are affected by its loss of activity. CCP1 is the largest member of the CCP family, being the one with the largest number of predicted domains. The elucidation organelle-specific functional roles have long been a factor that has contributed significatively to the study of CCPs. In this chapter have determined general considerations of CCP1 regarding its functional role using the knocking out of the gene in specific cell lines, focusing on its implications in general deglutamylation processes, describing its subcellular localisation, and its specific nuclear functional role. The second chapter was aimed for the identification of the human CCP1 and CCP6 interactomic landscapes under a biomedical point of view. Unveiling the protein-protein interactions can reveal how they are involved in different processes, providing hints or aid in determining their implication in disease. In this chapter the interactomic landscapes of CCP1 and CCP6 were generated from in vitro human cells, identifying new potential interactors and substrates which have allowed us to gain insight into their functional role. The proteomic work performed in this chapter was performed at the Bioscope Group (Universidade Nova de Lisboa, Portugal) headed by Professor Jose Luis Capelo under Dr. Hugo Santos surveillance. In last chapter we aimed for the characterisation of the conserved N-domain of cytosolic carboxypeptidases, focusing on CCP6 as the minimal CCP expression unit. This characteristic domain is conserved along the evolutionary line, being present in all identified CCPs, but not in other metallocarboxypeptidases. Although an extensive work has been conducted to describe the conserved catalytic domain, little is known about the N-domain and its implication in CCP activity. At present, the only information regarding the N-domain has been obtained from Caenorhabditis elegans. In this chapter, we evaluated the effects of this point mutation on the enzymatic activity of human CCP6 while assessing their implications in protein stability, subcellular localisation, and substrate specificity. The experimental work of this chapter was performed in collaboration with Paula Alfonso.