Fragments d’anticòs com a model d'estudi de l’amiloïdosi de cadena lleugera i com agents terapèutics per a la malaltia d’Alzheimer

Abstract

Els mecanismes de l’amiloidogènesi segueixen sent desconeguts. Les amiloïdosis són malalties incurables que solen acabar amb la vida dels pacients, i engloben un grup heterogeni de proteïnes. Les proteïnes amiloidogèniques agreguen formant dipòsits tant en els compartiments intracel·lulars com en els extracel·lulars, cosa que provoca la mort cel·lular i, posteriorment, el deteriorament dels teixits. Dues de les amiloïdosis més destructives són la malaltia d’Alzheimer, una amiloïdosis neurodegenerativa amb una alta prevalença, i l’amiloïdosi de cadena lleugera, una amiloïdosis sistèmica rara i mortal. L’amiloïdosi de cadena lleugera és difícil de diagnosticar i no existeix un tractament curatiu. De la mateixa manera, existeix una variabilitat de seqüència extremadament alta dins de la mateixa malaltia, que confereix a cada proteïna patogènica propietats bioquímiques i estructurals exclusives. L’AL-09 és un domini variable de cadena lleugera (VL) que es diferencia en set aminoàcids de la seva línia germinal, anomenada κI O18/O8. Aquestes mutacions fan que l’AL-09 presenti una interfície dimèrica alterada respecte a la seva línia germinal. S'ha postulat que aquesta interfície alterada és la principal responsable de la gran amiloidogenicitat de l'AL-09. En aquest treball, es van produir de manera recombinant el VVK08 i el VVA09, dos fragments variables de cadena senzilla (scFv) formats per dos dominis VL idèntics de les proteïnes esmentades anteriorment, amb l’objectiu principal d’estudiar aquesta interfície. Els resultats van permetre determinar que l'agregació del trímer del VVK08 passava per un estat intermediari que mostrava components β i random coil i que, a diferència del domini VL parental, seguia la via worm-like (WL). Així mateix, el dímer del VVA09 també va mostrar la capacitat d'agregar com a fibres WL, però, en condicions que afavorien un estat intermediari, l'agregació va transcórrer per la via amiloide. Aquest intermediari va mostrar un plegament tot β metaestable que corresponia a la forma tetramèrica del VVA09. Així, el sistema VVK08-VVA09 facilita l'estudi de la interfície responsable de l'amiloidogenicitat dels dominis VL i constitueix un sistema putatiu per al cribratge de fàrmacs. La malaltia d’Alzheimer és la demència més estesa. Segons la hipòtesi de la cascada amiloide, l'acumulació primerenca del pèptid Aβ desencadena la fosforilació de tau, la disfunció sinàptica i, en última instància, la mort neuronal i el deteriorament cognitiu. L’aparició d’anomalies en la imatge relacionades amb el pèptid amiloide (ARIA), com l’edema vasogènic (ARIA-E) o les lesions hemorràgiques (ARIA-H), trobades en assajos clínics d’immunoteràpia contra l’Aβ, s’ha relacionat amb la funció efectora de la fracció cristal·litzable (Fc) dels anticossos en l’activació glial. El grup on s’emmarca aquesta Tesi proposa l'ús de fragments variables de cadena senzilla, que no contenen la regió Fc, per establir una estratègia terapèutica més segura. L’scFv-h3D6 és un fragment variable de cadena lleugera derivat de l’anticòs monoclonal bapineuzumab (també anomenat mAb-h3D6), que ja ha demostrat la seva capacitat per reduir els nivells d’Aβ. En aquest estudi, es va avaluar l’efecte de l’scFv-h3D6 en la càrrega de tau en ratolins 3xTg-AD d’edat avançada. Breument, el tractament amb scFv-h3D6 no només va reduir els nivells d'Aβ, sinó també els nivells de tau total. És important remarcar que el tractament no va incrementar l'estat proinflamatori típic del model en aquesta edat. En conclusió, aquest estudi demostra la interconnexió entre els dos marcadors histopatològics de l’AD. Per altra banda, es van comparar els tractament amb mAb-m3D6, versió del bapineuzumab de ratolí, amb l’scFv-h3D6 utilitzant un altre model murí d’AD, l’APP23. Aquest model, a diferència del 3xTg-AD, desenvolupa angiopatia amiloide cerebral (CAA) i constitueix un model adient per a estudiar l’aparició d’ARIA emprant imatges per ressonància magnètica (MRI). Tot i que el mAb-m3D6 i l’scFv-h3D6 van reduir els nivells d'Aβ en la mateixa mesura, no es va observar cap efecte significatiu en el volum cerebral, ni en el dany axonal i el deteriorament de la mielina al cos callós, de manera que, com era d’esperar en etapes avançades de la malaltia, cap dels dos tractaments van ser capaços de revertir la neurodegeneració. No obstant això, l’anticòs sencer va produir un clar augment del nombre de noves lesions hemorràgiques, o ARIA-H, principalment al còrtex, mentre que l’scFv-h3D6 no. Per tant, els resultats permeten afirmar que el format scFv és més segur que el mAb sencer.

Los mecanismos de la amiloidogénesis siguen siendo desconocidos. Las amiloidosis son enfermedades incurables que suelen acabar con la vida de los pacientes, y engloban a un grupo heterogéneo de proteínas. Las proteínas amiloidogénicas agregan formando depósitos tanto en los espacios intracelulares como en los extracelulares, provocando la muerte celular y, posteriormente, el deterioro de los tejidos. Dos de las amiloidosis más destructivas son la enfermedad de Alzheimer, una amiloidosis neurodegenerativa con una alta prevalencia, y la amiloidosis de cadena ligera, una amiloidosis sistémica rara y mortal. La amiloidosis de cadena ligera es difícil de diagnosticar y no existe un tratamiento curativo. De igual modo, existe una variabilidad de secuencia extremadamente alta dentro de la misma enfermedad, que confiere a cada proteína patogénica propiedades bioquímicas y estructurales exclusivas. El AL-09 es un dominio variable de cadena ligera (VL) que se diferencia en siete aminoácidos de su línea germinal, llamada κI O18/O8. Estas mutaciones hacen que el AL-09 presente una interfaz dimérica alterada respecto a su línea germinal. Se ha postulado que esta interfaz alterada es la principal responsable de la gran amiloidogenicidad del AL-09. En este trabajo, se produjeron de forma recombinante el VVK08 y el VVA09, dos fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) formados por dos dominios VL idénticos de las proteínas mencionadas anteriormente, con el objetivo principal de estudiar esta interfaz. Los resultados permitieron determinar que la agregación del trímero del VVK08 pasaba por un estado intermediario que mostraba componentes β y random coil y que, a diferencia del dominio VL parental, seguía la vía worm-like (WL). Asimismo, el dímero del VVA09 también mostró la capacidad de agregar como fibras WL, pero, en condiciones que favorecían un estado intermediario, la agregación transcurrió por la vía amiloide. Este intermediario mostró un plegamiento todo β metaestable que correspondía a la forma tetramérica del VVA09. Así, el sistema VVK08-VVA09 facilita el estudio de la interfaz responsable de la amiloidogenicidad de los dominios VL y constituye un sistema putativo para el cribado de fármacos. La enfermedad de Alzheimer es la demencia más extendida. Según la hipótesis de la cascada amiloide, la acumulación temprana del péptido Aβ desencadena la fosforilación de tau, la disfunción sináptica y, en última instancia, la muerte neuronal y el deterioro cognitivo. La aparición de anomalías en la imagen relacionadas con el péptido amiloide (ARIA), como el edema vasogénico (ARIA-E) o las lesiones hemorrágicas (ARIA-H), encontradas en ensayos clínicos de inmunoterapia contra el Aβ, se ha relacionado con la función efectora de la fracción cristalizable (Fc) de los anticuerpos en la activación glial. El grupo en el que se enmarca esta Tesis propone el uso de fragmentos variables de cadena sencilla, que no contienen la región Fc, para establecer una estrategia terapéutica más segura. El scFv-h3D6 es un fragmento variable de cadena ligera derivado del anticuerpo monoclonal bapineuzumab (también llamado mAb-h3D6), que ya ha demostrado su capacidad para reducir los niveles de Aβ. En este estudio, se evaluó el efecto del scFv-h3D6 en la carga de tau en ratones 3xTg-AD de edad avanzada. De forma resumida, el tratamiento con scFv-h3D6 no sólo redujo los niveles de Aβ, sino también los niveles de tau total. Es importante remarcar que el tratamiento no incrementó el estado proinflamatorio típico del modelo a esa edad. En conclusión, este estudio demuestra la interconexión entre los dos marcadores histopatológicos de AD. Por otro lado, se compararon los tratamientos con mAb-m3D6, versión del bapineuzumab de ratón, con el scFv-h3D6 utilizando otro modelo murino de AD, el APP23. Este modelo, a diferencia del 3xTg-AD, desarrolla angiopatía amiloide cerebral (CAA) y constituye un modelo adecuado para estudiar la aparición de ARIA utilizando imágenes por resonancia magnética (MRI). Aunque el mAb-m3D6 y el scFv-h3D6 redujeron los niveles de Aβ en la misma medida, no se observó ningún efecto significativo en el volumen cerebral, ni en el daño axonal y el deterioro de la mielina en el cuerpo calloso, por lo que, como era de esperar en etapas avanzadas de la enfermedad, ninguno de los dos tratamientos fue capaz de revertir la neurodegeneración. Sin embargo, el anticuerpo entero produjo un claro aumento del número de nuevas lesiones hemorrágicas, o ARIA-H, principalmente en el córtex, mientras que el scFv-h3D6 no. Por tanto, los resultados permiten afirmar que el formato scFv es más seguro que el mAb entero.

Mechanisms of amyloidogenesis remain poorly understood. Amyloidoses are incurable life-threatening diseases, which encompass a heterogeneous group of proteins. Amyloid proteins aggregate as deposits either intracellularly or extracellularly, leading to cell death and subsequently to tissue impairment. Two of the most devastating amyloidosis are Alzheimer’s disease, a neurodegenerative amyloidosis with a high prevalence, and light chain amyloidosis, a rare and deadly systemic amyloidosis. Light chain amyloidosis is arduous to diagnose, and a curative treatment does not exist. Likewise, extremely high sequence variability occurs within the same disease, conferring exclusive biochemical and structural properties to each pathological protein. AL-09 is a light chain variable domain that differs by seven amino acids from its germline, called κI O18/O8. Such mutations generate an altered AL-09 dimer interface with respect to that by its germline. It has been postulated that the altered interface is the main responsible for the enhanced amyloidogenicity of AL-09. Here, we recombinantly produced VVK08 and VVA09, two single chain variable fragments composed of two identical VL domains from both proteins mentioned above, with the main aim of studying such interfaces. Results allowed us to determine that VVK08 trimer aggregation proceeds through an intermediate state that shows both β and random coil components and that, in contrast to the parental VL domain, follows the worm-like (WL) aggregation pathway. Likewise, VVA09 dimer demonstrated the ability to aggregate as worm-like fibrils as well but, in conditions favoring the occurrence of an intermediated state, aggregation proceeded through the amyloid pathway. This intermediate showed a metastable, all-β fold that corresponded to the tetrameric form of VVA09. Thus, the VVK08-VVA09 system facilitates the study of the interface behind amyloidogenicity of VL domains and constitutes a putative system for drug screening. Alzheimer’s disease is the most widespread dementia. According to the amyloid cascade hypothesis, the early accumulation of the Aβ-peptide triggers tau phosphorylation, synaptic dysfunction, and ultimately neuronal death and cognitive impairment. The occurrence of amyloid-related imaging abnormalities (ARIA), i.e., vasogenic edema (ARIA-E) and hemorrhagic events (ARIA-H), found in clinical trials for A-immunotherapy, has been related to the antibody’s effector function on glial activation by the Fc portion of the antibody. The use of single chain variable fragments, lacking the Fc portion, has been proposed by the research group hosting this work to constitute a safer therapeutic strategy. ScFv-h3D6 is a single-chain variable fragment derived from the monoclonal antibody bapineuzumab (also known as mAb-h3D6), that has already shown its ability to reduce amyloid burden. In this study, the effect of scFv-h3D6 on tau load has been assessed in elderly 3xTg-AD mice. Briefly, the treatment with scFv-h3D6 was, a part of effective in reducing Aβ levels, effective in reducing total tau levels as well. Interestingly, the pro-inflammatory state characterizing the model at this age did not increase. In conclusion, this study demonstrates the interplay between the two histopathological markers of AD. Besides, treatments with mAb-m3D6, the mouse version of bapineuzumab, and scFv-h3D6 were compared using the APP23 AD mouse model. APP23, unlike 3xTg-AD, develops cerebral amyloid angiopathy (CAA) and represents a suitable model to study the occurrence of ARIA by magnetic resonance imaging (MRI). Although mAb-m3D6 and scFv-h3D6 reduced Aβ levels to the same extent, no significant effect was observed in cerebral volume, nor axonal damage and myelin impairment were found in the corpus callosum, as expected at advanced stages of AD, where neither treatment could reverse neurodegeneration. Interestingly, mAb-m3D6 induced an increase in the number of new hemorrhagic events, mainly in the cortex, whereas scFv-h3D6 did not. In conclusion, our findings demonstrate that the scFv format is safer than the full-length mAb.