Utilidad y aplicación de diferentes técnicas (bioquímicas, proteómicas y moleculares) en la caracterización de Leishmania

Abstract

[spa] Las leishmaniosis son enfermedades causadas por el género Leishmania. Mientras que la clínica visceral se asocia al complejo L. donovani, la clínica tegumentaria puede estar producida por cualquier especie que afecte al humano. En España, el agente etiológico autóctono es L. infantum. Sin embargo, en las últimas décadas se han reportado casos importados asociados a otras especies. Dado que la especie causal puede influir en la evolución de la enfermedad, la identificación de la especie de Leishmania es especialmente útil en el ámbito asistencial, pero la compleja taxonomía del género y las discrepancias en cuanto a la validez de algunas especies pueden dificultar esta tarea. Actualmente, existe un amplio abanico de técnicas con diferentes características en cuanto a poder de discriminación, sencillez, coste etc. El objetivo de este trabajo ha sido la evaluación de distintas metodologías −electroforesis de enzimas multilocus (MLEE), secuenciación de distintas regiones genéticas y espectrometría de masas MALDI-TOF−, para abordar cuestiones como la controversia en la taxonomía del complejo L. donovani y la etiología y la epidemiología de la leishmaniosis tegumentaria en Cataluña. Se colaboró en la evaluación de una librería de espectros de referencia MALDI-TOF de Leishmania, accesible a través de una aplicación web gratuita. Esta, resultó ser una herramienta rápida y sencilla para la identificación de las leishmanias a nivel de especie, a pesar de que se observó riesgo de identificación incorrecta en el seno de los complejos más controvertidos. Se profundizó en el estudio del complejo L. donovani, analizando una representación de cepas previamente caracterizadas por MLEE como L. infantum, L. donovani y L. archibaldi, aisladas en 20 países, de humanos, reservorios y vectores. Se realizó la electroforesis de la enzima GOT, la secuenciación de los genes hsp70 y got y el MALDI-TOF. Además, se utilizaron secuencias obtenidas en un análisis de secuencias multilocus previo y la información completa del MLEE. Los resultados mostraron discrepancias entre los métodos basados en el estudio de la GOT y el resto. En la estructura del complejo, se observó poca variabilidad genética junto con indicios de intercambios genéticos en un gradiente este-oeste a través del área de distribución. Se detectó la dispersión a gran escala de genotipos concretos y la presencia de ecotipos. En conjunto, los marcadores utilizados no mostraron suficientes evidencias genéticas para separar L. infantum de L. donovani. Se estudió la etiología y la epidemiología de la leishmaniosis tegumentaria en Cataluña, a partir de cepas aisladas en los últimos 40 años en la región. Al mismo tiempo, se realizó una comparativa de la utilidad de diversas metodologías −MLEE, secuenciación de los genes hsp70, rpoIILS, fh y la región ITS2 y MALDI-TOF− para este propósito. Todas las técnicas ofrecieron identificaciones coincidentes a nivel de complejo, pero con distinto poder de discriminación. Los casos autóctonos fueron causados por L. infantum, existiendo una cepa tipo predominante y presente a lo largo del periodo. Los casos importados estaban causados por L. braziliensis, L. guyanensis, L. panamensis, L. tropica y L. major. Se identificaron cuatro zimodemas nuevos (MON-327−MON-330) en cepas procedentes de América Latina. Los resultados enfatizan la importancia de la identificación de la especie causal, especialmente en inmigrantes o en aquellos casos con historial de viaje. En conclusión, las técnicas de identificación aportan información relevante en contextos tan distintos como el asistencial, el taxonómico o el epidemiológico. No obstante, el MALDI-TOF y la secuenciación de los genes rpoIILS y fh serían técnicas más adecuadas para la práctica clínica por su rapidez y sencillez, mientras que la secuenciación del gen hsp70 y la región ITS2, al ofrecer mayor poder de discriminación, podrían substituir al MLEE en los estudios epidemiológicos.

[eng] In Spain, leishmaniasis are caused by Leishmania infantum. However, imported cases associated with other species have been reported. As the causal species can influence in the disease, its identification is especially useful in the healthcare field. Nevertheless, identification could be hampered by the complex taxonomy of the genus and the discussed validity of some species. Our aim was to evaluate different methodologies based on biochemical, molecular and proteomic markers to address issues like the controversy surrounding the taxonomy of the L. donovani complex and the aetiology of tegumentary leishmaniasis in Catalonia. We collaborated in the evaluation of a MALDI-TOF mass spectral library accessible in a web application. It turned out to be a fast and simple tool for Leishmania identification at the species level, although misidentifications within the most controversial complexes were observed. To the study of the L. donovani complex, a representation of strains was analysed by enzyme electrophoresis, sequencing of the hsp70 and got genes and MALDI-TOF. Additionally, sequences from a previous multilocus analysis were used. There were discrepancies between the methods based on the GOT enzyme and the rest. Regarding the structure of the complex, low genetic variability was observed together with frequent genetic exchanges in an east-west gradient throughout the distribution area, large-scale dispersion of specific genotypes and presence of ecotypes. The markers used did not show enough genetic evidence to separate L. infantum from L. donovani. To study the aetiology and epidemiology of tegumentary leishmaniasis in Catalonia, we used strains isolated in the region in the last 40 years. Besides, the utility of different methodologies was compared. Autochthonous cases were caused by L. infantum and one strain type prevailed throughout the studied period. Imported cases were caused by five species. Four new zymodemes were identified. These results emphasize the importance of identifying the causal species when travel history is reported. The MALDI-TOF and the sequencing of the rpoIILS and fh genes would be appropriate techniques for the clinical practice due to their speed and simplicity, while the sequencing of the hsp70 gene and the ITS2 region, offering greater discrimination power, could replace MLEE in the epidemiological field.