Mecanismos de remodelado y calcificación cardiovascular: papel del receptor nuclear NOR-1 y la LOX

Abstract

[spa] La calcificación cardiovascular (CCV) afecta a arterias y válvulas comprometiendo su normal funcionamiento y aumentando el riesgo de sufrir accidentes cardiovasculares y de desarrollar hipertrofia cardíaca e insuficiencia cardiaca, entre otros. Actualmente no existen tratamientos eficaces que prevengan o reduzcan la CCV. Nuestro grupo había descrito la sobreexpresión del receptor nuclear NOR-1 en lesiones ateroscleróticas humanas y su inducción en células endoteliales y células musculares lisas vasculares (CMLVs) por estímulos que promueven disfunción endotelial y potencian la migración y proliferación de ambos tipos celulares. La Lisil Oxidasa (LOX) es una enzima que cataliza el entrecruzamiento de las fibras de colágeno y elastina en el proceso de maduración de la matriz extracelular (MEX). Nuestro grupo había caracterizado la implicación de LOX en la disfunción endotelial y el remodelado vascular, y cómo la actividad LOX contribuye al estrés oxidativo y a la rigidez vascular. En el presente trabajo hemos profundizado en el estudio de los mecanismos celulares y moleculares por los que NOR-1 y LOX participan en la CCV. Detectamos aumento de los niveles de expresión de NOR-1 tanto en válvulas aórticas como en lesiones ateroscleróticas humanas calcificadas, en las que colocalizó con marcadores de calcificación como RUNX2 (Runt-related transcription factor 2) y osteopontina (OPN). La expresión endógena de NOR-1 aumentó al incubar células instersticiales de válvula aórtica (VICs) o CMLVs humanas con un medio con alto contenido en fosfato que indujo calcificación. La sobreexpresión de NOR-1 en VICs expuestas a éste medio limitó la inducción de los marcadores de diferenciación osteoblástica/calcificación y la mineralización de la MEX. Además, al exponer a medio osteogénico CMLVs o anillos aórticos de ratones que sobreexpresan NOR-1 en las CMLVs (TgNOR-1CMLV) la expresión de los marcadores de calcificación y la mineralización de la MEX fue menor que en células o anillos aórticos de animales control. Finalmente, al inducir hiperlipidemia y aterosclerosis experimental (mediante la administración de AAV-PCSK9D374Y y dieta aterogénica) observamos que la transgénesis de NOR-1 disminuye el desarrollo de aterosclerosis a nivel de la aorta y la calcificación de las lesiones ateroscleróticas. Las lesiones ateroscleróticas de animales TgNOR-1CMLV eran de menor tamaño y tenían menor infiltrado inflamatorio; además, estaban menos calcificadas y presentaban menor expresión de marcadores osteogénicos, menor grado de entrecruzamiento del colágeno y menor contenido de glucosaminoglucanos que las de los animales control. Por lo tanto, NOR-1 reduce la calcificación de células en cultivo y la calcificación de la íntima asociada a la aterosclerosis. En relación al impacto de LOX en la CCV, observamos una mayor expresión de esta enzima tanto en válvulas aórticas calcificadas como en placas ateroscleróticas humanas en las que colocalizaba con RUNX2. Al inducir la calcificación de VICs con un medio rico en fosfato observamos un aumento de la secreción de la LOX que promovió la maduración de la MEX y su mineralización de forma dependiente de su actividad catalítica. Al inducir aterosclerosis mediante la administración de AAV-PCSK9D374Y y dieta aterogénica, los ratones que sobreexpresan LOX en las CMLVs de la pared vascular (TgLOXCMLV) presentaron mayor desarrollo de aterosclerosis en la aorta y mayor calcificación de las lesiones. Las lesiones ateroscleróticas de ratones TgLOXCMLV tenían más infiltrado inflamatorio y una cubierta fibrosa más rica en CMLVs y más engrosada. El análisis de la calcificación evidenció que las placas de ratones TgLOXCMLV estaban más calcificadas y presentaban mayor expresión de marcadores osteogénicos, mayor grado de entrecruzamiento de colágeno y mayor contenido de glucosaminoglucanos que las de los animales control. Por lo tanto, nuestro estudio proporciona evidencias tanto in vitro como in vivo del papel clave de la LOX en la CCV.

[eng] Background: Cardiovascular calcification (CVC) is a global health concern whose underlying mechanisms are not fully understood and for which there are no effective therapies. We described NOR-1 expression in human atherosclerotic lesions and its induction by atherogenic stimuli; however, its contribution to CVC is unknown. We have also outlined the potential contribution of LOX, an enzyme involved in matrix remodeling, in biomineralization of vascular smooth muscle cells (VSMCs), but it is uncertain whether LOX could participate in valvular calcification and in atherosclerosis-related mineralization. Methods: Human samples of calcific aortic valves and atherosclerotic lesions, as well as valvular interstitial cells (VICs) and VSMCs exposed to high phosphate medium were analyzed. To induce atherosclerosis and calcification, transgenic mice overexpressing NOR-1 or LOX in VSMCs (TgNOR-1VSMC or TgLOXVSMC) were transduced with AAV-PCSK9D374Y and fed a high fat/high cholesterol diet. Results: Higher levels of NOR-1, as well as osteogenic markers (RUNX2 and osteopontin), were detected in human calcified aortic valves and in atherosclerotic lesions in which NOR-1 colocalized RUNX2. NOR-1 expression increased when calcification was induced in human cells (VICs and VSMCs) or mouse VSMCs. Gain- and loss-of-function approaches determined that NOR-1 modulates genes involved in osteoblastic transdifferentiation and extracellular matrix (ECM) mineralization. VSMCs and aortic rings from TgNOR-1VSMC mice exposed to osteogenic media exhibited reduced expression of osteogenic markers and decreased mineralization. NOR-1 transgenesis decreased atherosclerosis and intimal calcification. Lesions from transgenic mice had lower expression of osteogenic markers, lower degree of collagen crosslinking and lower content of glycosaminoglycans. We also observed increased LOX expression in both human calcified aortic valves and atherosclerotic plaques in which LOX colocalized with RUNX2. The induction of calcification in VICs increased LOX secretion which promoted ECM maturation and its mineralization in a manner dependent on its catalytic activity. LOX transgenesis promoted aortic atherosclerosis and intimal calcification. Lesions showed greater inflammatory content and thicker fibrous cap. Plaques from TgLOXVSMC also exhibited greater content of osteogenic markers, cross-linked collagen and glycosaminoglycans. Conclusions: Our results highlight the impact of NOR-1 reducing CVC calcification and the critical role of LOX-dependent ECM crosslinking in the process of matrix mineralization