Industrial Production of Vitamin B12 with Propionibacterium freudenreichii subs shermanii

Abstract

La vitamina B12, coneguda també com a cobalamina (cbl), és una vitamina soluble en aigua essencial per a molts organismes. Es va començar a estudiar a la dècada de 1920 com un tipus de "factor extern" capaç de curar i prevenir l'anèmia perniciosa. Aquesta molècula altament complexa es va aïllar per primera vegada el 1950.

Des d'aquest punt, i a causa de la seva importància fisiològica, s'ha estudiat extensament. La seva estructura (un anell tetrapirròlic amb un ió central de Co similar a altres grups prostètics) i la seva síntesi química s'han elucidat completament. No obstant això, a causa de la complexitat i els baixos rendiments de la ruta de síntesi, la fermentació amb microorganismes amb una alta capacitat de producció encara és el mètode preferit per a la seva producció industrial.

Aquest projecte de tesi, realitzat en col·laboració entre HealtechBioactives (HTBA) i el "Grup de Química Biològica y Biotecnològica" (GQBB) a l'Institut Químic de Sarrià (IQS), es centra en optimitzar el creixement i augmentar la producció de vitamina B12 amb una soca wild type de Propionibacterium freudenreichii subs shermanii: NBRC 12391, un microorganisme anaeròbic.

Tot i que la majoria de la producció industrial actual es fa amb soques aeròbiques modificades (com Pseudomonas denitrificans) o soques de Propionibacterium resistent a propiónic obtenides mitjançant mutagènesi aleatòria, aquest projecte es va centrar en una soca wild type, després de considerar les peculiaritats del mercat de la vitamina B12, on la gran consciència sobre la salut i l'ecologia per part de molts consumidors podria comportar avantatges estratègics i comercials en l'ús d'un microorganisme wilt type, GRAS (generalment reconegut com a segur) i no modificat genèticament per a la producció de vitamina B12. Per aquest motiu, tota l'optimització i les estratègies descrites en aquest projecte es van realitzar a nivell de bioproces i no es va utilitzar l'enginyeria genètica.

Sendo aquest projecte el primer en el grup de recerca basat en la producció anaeròbica amb soques de Propionibacterium, molts dels esforços inicials es van centrar en desenvolupar una metodologia de cultiu robusta i fiable, incloent l'estudi de la composició del medi, les estratègies d'addició de suplements, les condicions de cultiu, la regulació del pH, etc. A més, es va implementar un procediment fiable d'extracció de cobalamina, així com un mètode analític basat en HPLC per a la identificació i quantificació de la cobalamina.

Un cop el procés de cultiu es va implementar amb èxit, es van provar diverses estratègies per optimitzar el creixement del cultiu i la productivitat del cultiu.. En aquest sentit, es van avaluar diversos punts: l'efecte de l'oxigenació inicial del cultiu en la producció de Cbl, l'addició de diferents suplements de Cbl i els seus moments d'addició, l'addició de nitrat, l'efecte de la natura de la solució base, així com l'efecte de l'àcid propiònic en el creixement cel·lular i la producció.

Es va concloure que l'agitat inicial era perjudicial per a la producció de Cbl, probablement a causa d'una major oxigenació durant la fase anaeròbica del cultiu. A més, es va considerar essencial l'addició de DMBI per a una alta producció de Cbl. Finalment, es va observar que l'àcid propiònic tenia un efecte negatiu significatiu tant en el creixement com en la producció, com s'esperava.

Amb aquestes dades, el procés es va escalar a un biorreactor d'escala de laboratori en diversos bioprocessos de batch i de fed-batch en diferents condicions. No obstant això, la producció en aquests cultius va ser més baixa del que s'esperava a causa de les limitacions de la font de carboni i de la inhibició de l'àcid propiònic.

Per aquest motiu, es va desenvolupar un bioproces continu en una sola fase. Això va ser possible gràcies a que i) la capacitat de NBRC 12391 d'arribar a una producció volumètrica màxima de Cbl en menys de 24 hores després de l'addició de DMBI i ii) el fet que NBRC 12391 pot produir Cbl en condicions anaeròbiques en lloc de requerir una fase microaerofílica per arribar a la seva producció màxima. L'estratègia continua va permetre un augment significatiu de la productivitat volumètrica de Cbl en un 5,7 vegades en comparació amb el millor procés de batch. Això ofereix una nova estratègia viable per al desenvolupament de futures i sostenibles estratègies per produir CNCbl amb soques wild type de P. freudenreichii GRAS sense haver de confiar en configuracions més complexes com bioprocessos contínus de múltiples fases o biorreactors d'adsorció en un llit expansiu per a l'eliminació de l'àcid propiònic.

Finalment, també es van avaluar altres estratègies per optimitzar encara més la producció de Cbl i possiblement incorporar-les en el bioproces continu en una sola fase, com la co-cultura amb soques que consumeixen àcids orgànics o formulacions de mitjans més optimitzades.

La vitamina B12, también conocida como cobalamina (cbl), es una vitamina soluble en agua esencial para muchos organismos. En primer lugar, se estudió en la década de 1920 como un tipo de "factor extrínseco" capaz de curar y prevenir la anemia perniciosa. Esta molécula altamente compleja se aisló por primera vez en 1950.

A partir de este punto, y debido a su importancia fisiológica, se ha estudiado ampliamente. Su estructura (un anillo tetrapirrólico con un ión central de Co similar a otros grupos prostéticos) y su síntesis química se han elucidado completamente. Sin embargo, debido a la complejidad y los bajos rendimientos de la ruta de síntesis, la fermentación con microorganismos con una alta capacidad de producción sigue siendo el método preferido para la producción industrial de la vitamina B12.

Este proyecto de tesis, realizado en colaboración entre HealtechBioactives (HTBA) y el "Grupo de Química Biológica y Biotecnológica" (GQBB) en el Instituto Químico de Sarrià (IQS), se centra en optimizar el crecimiento y aumentar la producción de vitamina B12 con una cepa wild type de Propionibacterium freudenreichii subs shermanii: NBRC 12391, un microorganismo anaeróbico.

Aunque la mayoría de la producción industrial actual se realiza con cepas aeróbicas modificadas (como Pseudomonas denitrificans) o cepas de Propionibacterium resistentes a propiónico obtenidas mediante mutagénesis aleatoria, este proyecto se centró en una cepa wild type, después de considerar las peculiaridades del mercado de la vitamina B12, donde la gran conciencia sobre la salud y la ecología por parte de muchos consumidores podría comportar ventajas estratégicas y comerciales en el uso de un microorganismo wild type, GRAS (generalmente reconocido como seguro) y no modificado genéticamente para la producción de vitamina B12. Por este motivo, toda la optimización y las estrategias descritas en este proyecto se llevaron a cabo a nivel de bioproceso y no se utilizó la ingeniería genética.

Al ser este proyecto el primero en el grupo de investigación basado en la producción anaeróbica con cepas de Propionibacterium, muchos de los esfuerzos iniciales se centraron en desarrollar una metodología de cultivo robusta y fiable, incluido el estudio de la composición del medio, las estrategias de adición de suplementos, las condiciones de cultivo, la regulación del pH, etc. Además, se implementó un procedimiento fiable de extracción de cobalamina, así como un método analítico basado en HPLC para la identificación y cuantificación de la cobalamina.

Una vez que el proceso de cultivo se implementó con éxito, se probaron varias estrategias para optimizar el crecimiento del cultivo y la productividad de la vitamina B12. En este sentido, se evaluaron varios puntos: el efecto de la oxigenación inicial del cultivo en la producción de Cbl, la adición de diferentes suplementos de Cbl y sus momentos de adición, la adición de nitrato, el efecto de la naturaleza de la solución base, así como el efecto del ácido propiónico en el crecimiento celular y la producción.

Se concluyó que la agitación inicial era perjudicial para la producción de Cbl, probablemente debido a una mayor oxigenación durante la fase anaeróbica del cultivo. Además, se consideró esencial la adición de DMBI para una alta producción de Cbl. Finalmente, se observó que el ácido propiónico tenía un efecto negativo significativo tanto en el crecimiento como en la producción, como se esperaba.

Con estos datos, el proceso se escaló a un biorreactor de escala de laboratorio en varios bioprocesos debatch y fed-batch o en diferentes condiciones. Sin embargo, la producción en estos cultivos fue más baja de lo esperado debido a las limitaciones de la fuente de carbono y la inhibición del ácido propiónico.

Por este motivo, se desarrolló un bioproceso continuo en una sola fase. Esto fue posible gracias a que i) la capacidad de NBRC 12391 de alcanzar una producción volumétrica máxima de Cbl en menos de 24 horas después de la adición de DMBI y ii) el hecho de que NBRC 12391 puede producir Cbl en condiciones anaeróbicas en lugar de requerir una fase microaerofílica para alcanzar su máxima producción. La estrategia continua permitió un aumento significativo de la productividad volumétrica de Cbl en un 5.7 veces en comparación con el mejor proceso de batch. Esto ofrece una nueva estrategia viable para el desarrollo de estrategias futuras y sostenibles para producir CNCbl con cepas wild type de P. freudenreichii GRAS sin tener que depender de configuraciones más complejas como bioprocesos continuos de múltiples fases o biorreactores de adsorción en un lecho expandido para la eliminación del ácido propiónico.

Finalmente, también se evaluaron otras estrategias para optimizar aún más la producción de Cbl y posiblemente incorporarlas en el bioproceso continuo en una sola fase, como la co-cultura con cepas que consumen ácidos orgánicos o formulaciones de medios más optimizadas.

Vitamin B12, also known as cobalamin (cbl) is a water-soluble vitamin essential for many organisms. Firstly, studied in 1920s as a sort of “extrinsic factor” capable of curing and preventing pernicious anemia, this highly complex molecule was isolated for the first time in 1950.

From this point, and due to its physiological importance, it has been extensively studied. Its structure (a tetrapyrrolic ring with a central Co ion similar to other prosthetic groups) and its chemical synthesis have been fully elucidated. However, due to the complexity and low yields of the synthesis route, fermentation with high-producing microorganisms is still the preferred way for the industrial production of vitamin B12.

This thesis project, done in collaboration between HealtechBioactives (HTBA) and the “Grupo de Química Biológica y Biotecnológica” (GQBB) at Institut Químic de Sarrià (IQS), focuses on optimizing growth and increasing vitamin B12 production with a wild type of strain of the anaerobic Propionibacterium freudenreichii subs shermanii: NBRC 12391.

Despite the majority of the current industrial production being done with modified aerobic strains (like Pseudomonas denitrificans) or random mutagenesis obtained propionic-resistant Propionibacterium strains, this project focused on a wild type strain after considering the peculiarities of the vitamin B12 market, where the high health and ecological awareness of many of its consumer may lead to strategic and commercials advantages when using a wild type, GRAS and non-GMO microorganism for vitamin B12 production. For this reason, all the optimization and strategies described in this project were performed at a bioprocess level and no genetic engineering was involved.

Being this project the first in the research group based on the anaerobic production with Propionibacterium strains, many of the early efforts were centered around developing a robust and reliable culture methodology, including studying media composition, supplement addition strategies, culture conditions, pH regulation, etc. Besides, a reliable cobalamin extraction procedure was also implemented alongside a HPLC-based analytical method for cobalamin identification and quantification.

Once the culture process was successfully implemented, several strategies were tested in order to optimize culture growth and productivity. In this sense, several points were assessed: the effect on Cbl production of the early culture oxygenation, the addition of different Cbl supplements and their addition times, the addition of nitrate, the effect of the nature of the base solution as well as the effect of propionic acid in both cell growth and production.

It was concluded that early agitation was detrimental to Cbl production most likely due to an increased oxygenation during the anaerobic phase of the culture. Besides, the addition of DMBI was deemed essential for high Cbl production. Finally, propionic acid showed a significant negative effect in both growth and production, as expected.

With this data, the process was scale-up to a laboratory-scale bioreactor in several batch and fed-batch bioprocesses at different conditions. However, production in these cultures was lower than expected due to carbon source limitations and propionic acid inhibition.

For this reason, a single-phase continuous bioprocess was developed. This was possible thanks to i) the capacity of NBRC 12391 of reaching maximum Cbl volumetric production in less than 24-h after DMBI addition and ii) the fact that NBRC 12391 can produce Cbl in anerobic conditions instead of requiring a microaerophilic phase to reach its maximum production. The continuous strategy allowed for a significant increase in Cbl volumetric productivity by 5.7 folds compared to the best batch process. This provides a new viable strategy for the development of future and sustainable strategies to produce CNCbl with wild-type GRAS P. freudenreichii strains without having to rely on more complicated setups like multiple-phase continuous bioprocesses or expanded bed adsorption bioreactors for propionic acid elimination.

Finally, other strategies were also assessed to further optimize Cbl production and possibly incorporate them into the single-phase continuous bioprocess like the co-culture with organic acid-consuming strains or more optimized media formulations.