Análisis del potencial de los blastómeros del embrión de ratón a 8 células para generar células madre embrionarias

Abstract

Las células madre embrionarias de ratón suelen derivarse de embriones en estadio de blastocisto, pero alternativamente pueden obtenerse a partir de blastómeros aislados del embrión a 8 células (Bm-mESCs). Sin embargo, la eficiencia de derivación a partir de blastómeros (25-50%) es menor que a partir de blastocitos (85%), lo cual puede deberse a una limitación técnica o a una limitación biológica inherente presente en alguno/s de los blastómeros. Esto último hace referencia a una posible predisposición de algunos blastómeros hacia un destino celular no pluripotente que impida generar Bm-ESCs a partir de ellos. Por ello, el principal objetivo de esta tesis es determinar la capacidad de los blastómeros del embrión a 8 células para generar líneas Bm-ESCs y analizar si dichas líneas comparten propiedades semejantes. En un primer trabajo, se buscó optimizar las condiciones técnicas del proceso de derivación, con el objetivo de aumentar la probabilidad de obtener 8 líneas Bm-ESC de un mismo embrión. Para ello, se estudió el efecto de moduladores de las vías de señalización implicados en pluripotencia (cocteles 2i y R2i), suplementos como la hormona adrenocorticotropa (ACTH), el uso de embriones criopreservados o el precultivo de los embriones con 2i o R2i, sobre las tasas de derivación de Bm-ESCs así como sobre la integridad del cariotipo y la expresión de marcadores de pluripotencia de las líneas generadas. El uso de R2i junto con ACTH y embriones criopreservados generó las mayores tasas de derivación a partir de blastómeros aislados (39%) de entre todos los tratamientos aplicados. Además, el uso de R2i dio lugar a una mayor integridad cromosómica de las líneas mESC generadas frente a 2i. Finalmente, el cultivo de los embriones con R2i aumentó el número de células del epiblasto en los blastocistos, aunque esto no se tradujo en un incremento en las tasas de derivación cuando los blastómeros aislados de los embriones tratados se utilizaron para generar mESC. En un segundo estudio se analizó la capacidad de los blastómeros hermanos del embrión a 8 células para generar células del epiblasto y líneas Bm-ESCs. Se observó que la mitad o menos de los blastómeros hermanos presentaban un mayor potencial para generar líneas Bm-ESCs. Sin embargo, la obtención de más de 4 líneas a partir de varios de los embriones usados demostró que los blastómeros con menor potencial también podían generar líneas Bm-ESCs. Esto puede deberse al uso del cocktail R2i durante el proceso de derivación, que podría redirigir el destino celular no pluripotente de los blastómeros con menor potencial hacia un destino pluripotente. Por lo tanto, parece que las características biológicas de cada blastómero, así como su plasticidad tras el aislamiento y las condiciones de cultivo, tienen un efecto sobre las tasas de derivación obtenidas. Por último, se analizó el transcriptoma de las líneas Bm-ESCs generadas a partir de distintos blastómeros del mismo embrión. Se observó que, para cada embrión, la mitad de las líneas generadas presentaban una mayor expresión de genes relacionados con la pluripotencia y el desarrollo que la otra mitad, lo que sugiere que probablemente se originaron a partir de aquellos blastómeros con un mayor potencial de desarrollo. En conjunto, el desarrollo de esta tesis ha permitido, por un lado, mejorar y simplificar el proceso de derivación de Bm-ESCs y, por otro lado, determinar que los blastómeros del embrión a 8 células poseen diferente habilidad para generar líneas de Bm-ESCs, si bien esta puede modularse mediante unas condiciones de cultivo adecuadas. En definitiva, el presente trabajo proporciona un mayor conocimiento sobre el potencial de desarrollo de los blastómeros del embrión preimplantacional de ratón, así como del proceso de derivación de Bm-ESCs.

Mouse embryonic stem cells are usually derived from embryos at the blastocyst stage, but, alternatively, they can be obtained from isolated blastomeres from the 8-cell embryo (Bm-mESCs). However, the derivation efficiency from blastomeres (25-50%) is lower than from blastocysts (85%). This situation could be due to a technical limitation or to an inherent biological limitation of some blastomeres. The latter refers to a possible predisposition of some blastomeres towards a non-pluripotent cell fate that would prevent the generation of mESCs from them. Therefore, the main objective of this thesis is to determine the ability of the 8-cell embryo blastomeres to generate Bm-ESCs lines and to analyse whether these lines share similar properties. In a first study, we aimed to optimize the technical conditions of the derivation process, in order to increase the probability of obtaining 8 Bm-ESCs lines from the same embryo. For this purpose, we evaluated the effect of modulators of signaling pathways involved in pluripotency (2i or R2i cocktails), supplements such as adrenocorticotropic hormone (ACTH), the use of cryopreserved embryos or embryo preculture with 2i or R2i, on the rates of Bm-ESCs derivation, as well as on karyotype integrity and the expression of pluripotency markers in the lines generated. The use of R2i together with ACTH and cryopreserved embryos produced the highest derivation rates from isolated blastomeres (39%) among all the treatments applied. Furthermore, the use of R2i provided higher karyotype integrity of the lines generated compared with 2i. Finally, culturing the embryos with R2i increased the number of epiblast cells in the blastocysts, although this did not translate into a higher derivation rate when isolated blastomeres from treated embryos were used to produce mESCs. In a second study, the ability of sister blastomeres of the 8-cell embryo to generate epiblast cells and Bm-ESCs lines was analysed. It was observed that half or less of the sister blastomeres had a greater potential to produce Bm-ESCs lines. However, the obtention of more than 4 lines from several embryos demonstrated that the blastomeres with lower potential could also generate Bm-ESC lines. This could be due to the use of the R2i cocktail during the derivation process, which could redirect the non-pluripotent cell fate of lower potential blastomeres towards a pluripotent fate. Therefore, the biological characteristics of each blastomere, as well as their plasticity after isolation and the culture conditions, have an influence on the derivation rates obtained. Finally, the transcriptome of the Bm-ESC lines generated from different blastomeres of the same embryo was studied. It was observed that, for each embryo, half of the lines generated showed higher expression of genes related to pluripotency and development than the other half, suggesting that they may have originated from those blastomeres with the greatest developmental potential. However, no evident differences were observed among lines in terms of their capacity to differentiate into cells of the three germ layers. All in all, the development of this thesis has allowed, on one hand, to improve and simplify the process of Bm-ESC derivation from isolated blastomeres and, on the other hand, to determine that blastomeres of the 8-cell embryo have different ability to generate Bm-ESC lines, although this can be modulated by appropriate culture conditions. In conclusion, the present work improves our knowledge of the developmental potential of the blastomeres of the preimplantation mouse embryo, as well as of the Bm-ESCs derivation process.