AAV-mediated expression of Secreted Klotho as a therapeutic strategy for Alzheimer’s disease

Abstract

La malaltia d’Alzheimer (MA), la principal forma de demència, es caracteritza per la pèrdua progressiva de memòria i capacitats cognitives. Els marcadors neuropatològics de la MA són dipòsits de β-amiloide (Aβ) i Tau al cervell, juntament amb neuroinflamació, estrès oxidatiu, disfunció autofàgica i neurodegeneració. Malgrat que s’han desenvolupat moltes teràpies contra Aβ i Tau, encara no existeix cap tractament que curi o previngui la MA. El fracàs dels assajos clínics podria deure’s a la naturalesa multifactorial de la MA i/o la baixa traslacionabilitat dels models animals preclínics. Així, sorgeixen dues línies d’investigació: d’una banda, explotar molècules pleiotròpiques per contrarestar diversos processos neuropatològics de la MA; d’altra banda, implementar models preclínics més traslacionals. La proteïna neuroprotectora i antienvelliment Klotho (KL) té un gran potencial com a molècula terapèutica per les seues funcions pleiotròpiques, entre altres, millora de les capacitats cognitives, la plasticitat sinàptica i l’autofàgia, protecció davant l’estrès oxidatiu i reducció de la neuroinflamació. No obstant, es desconeix quina de les variants, la secretada (sKL) o la transmembrana (mKL), desenvolupa aquestes funcions al sistema nerviós central humà, atès que la recerca prèvia està centrada en mKL i models murins. En aquest treball, l’expressió gènica relativa de sKL i mKL s’ha caracteritzat al cervell humà, tant en individus sans com en pacients MA. Curiosament, sKL va resultar la variant més expressada en còrtex frontal i entorrinal, hipocamp i amígdala, mentre que a plexus coroide predominava mKL. Per contra, en ratolins mKL és majoritària, per tant la ràtio d’expressió sKL/mKL està invertida al cervell de ratolí respecte a l’humà. En MA, l’expressió de sKL i mKL aparegué alterada, tant en pacients MA com en ratolins 3xTg-AD comparant amb humans sans i ratolins WT, respectivament. A nivell proteic, trobàrem que el nivells de KL soluble en líquid cefalorraquidi (LCR) estaven significativament disminuïts en pacients MA, així com una correlació positiva entre edat avançada i nivells de KL en LCR en pacients MA, però no en individus sans. A més, de forma interessant, els portadors de l’al·lel APOE4, principal factor de risc genètic de MA, presentaven nivells més baixos de KL en LCR. A partir d’aquests resultats en humans, ens vam centrar en explorar el potencial de sKL per contrarestar els dèficits cognitius de MA. Per a això, administrarem vectors AAV9-sKL en cervell de dos models murins de MA (3xTg-AD i APP/Tau) per expressar sKL i avaluar el seu efecte en les capacitats cognitives mitjançant tests conductuals. La expressió de sKL mediada per AAV9 tendí tant a millorar l’aprenentatge espacial i la memòria de referència (al test MWM) en femelles 3xTg-AD i mascles APP/Tau, com la memòria de reconeixement i espacial (al NOR i T-Maze tests) en femelles APP/Tau i WT. Malauradament, els dos models de MA mancaven de dèficits cognitius profunds a les edats analitzades, consegüentment l’efecte de sKL a la conducta avaluada mitjançant tests fou lleu. Finalment, aquest treball també ha destacat la viabilitat dels organoids cerebrals humans com a model preclínic en investigació de teràpia gènica amb vectors AAV, ja que s’optimitzà un protocol de transducció i es demostrà que la càpside AAV7m8 és molt eficient, i superior a AAV9, per transduir organoids cerebrals humans. Així, la traslacionabilitat de la investigació preclínica en malalties neurològiques podria incrementar-se utilitzant organoids cerebrals humans com a model complementari als animals experimentals, especialment per desenvolupar estratègies terapèutiques basades en la transferència gènica mitjançant AAV. Estudis futurs haurien d’explorar el potencial de sKL expressat mitjançant AAV per contrarestar els símptomes de MA en ratolins amb dèficits cognitius profunds, mentre que a nivell molecular queda per analitzar l’efecte de sKL in vivo i en organoids cerebrals humans.

La enfermedad de Alzheimer (EA), la principal forma de demencia, se caracteriza por la pérdida progresiva de memoria y capacidades cognitivas. Los marcadores neuropatológicos de EA son depósitos de β-amiloide (Aβ) y Tau en cerebro, acompañados de neuroinflamación, estrés oxidativo, disfunción autofágica y neurodegeneración. Aunque se han desarrollado muchas terapias contra Aβ y Tau, todavía no existe ningún tratamiento que cure o prevenga la EA. El fracaso de los ensayos clínicos podría deberse a la naturaleza multifactorial de la EA y/o la baja traslacionabilidad de los modelos animales preclínicos. Así surgen dos líneas de investigación: explotar moléculas pleiotrópicas para contrarrestar múltiples procesos neuropatológicos de EA; e implementar modelos preclínicos más traslacionales. La proteína neuroprotectora y antienvejecimiento Klotho (KL) tiene gran potencial como molécula terapéutica por sus funciones pleiotrópicas, entre otras, mejora de las capacidades cognitivas, la plasticidad sináptica y la autofagia, protección frente al estrés oxidativo y reducción de la neuroinflamación. Sin embargo, se desconoce cuál de las variantes, la secretada (sKL) o la transmembrana (mKL), desarrolla estas funciones en el sistema nervioso central humano, ya que la investigación previa está centrada en mKL y modelos murinos. En este trabajo, la expresión génica relativa de sKL y mKL se caracterizó en el cerebro humano, tanto en individuos sanos como pacientes EA. Curiosamente, sKL resultó la variante más expresada en córtex frontal y entorrinal, hipocampo y amígdala, mientras que en plexus coroide predominaba mKL. Por el contrario, en ratones, mKL es mayoritaria, por lo que la ratio de expresión sKL/mKL está invertida en cerebro de ratón respecto al humano. En EA, la expresión de sKL y mKL apareció alterada, tanto en pacientes EA como en ratones 3xTg-AD comparando con humanos sanos y ratones WT, respectivamente. A nivel proteico, hallamos que los niveles de KL soluble en líquido cefalorraquídeo (LCR) estaban significativamente disminuidos en pacientes EA, así como una correlación positiva entre edad avanzada y niveles de KL en LCR en pacientes EA, pero no en individuos sanos. Además, los portadores del alelo APOE4, principal factor de riesgo genético de EA, presentaban niveles más bajos de KL en LCR. En base a estos hallazgos en humanos, nos centramos en explorar el potencial de sKL para contrarrestar los déficits cognitivos en EA. Para ello, administramos vectores AAV9-sKL en cerebro de dos modelos murinos de EA (3xTg-AD y APP/Tau) para expresar sKL y evaluar su efecto en las capacidades cognitivas mediante tests conductuales. La expresión de sKL mediada por AAV9 tendió a mejorar tanto el aprendizaje espacial y la memoria de referencia (en el test MWM) en hembras 3xTg-AD y machos APP/Tau, como la memoria de reconocimiento y espacial (en NOR y T-Maze) en hembras APP/Tau y WT. Desafortunadamente, los dos modelos murinos de EA carecían de déficits cognitivos profundos a las edades analizadas, por lo que el efecto de sKL en la conducta evaluada mediante tests fue leve. Finalmente, este trabajo también destaca la viabilidad de los organoides cerebrales humanos como modelo preclínico en investigación de terapia génica con vectores AAV, ya que se optimizó un protocolo de transducción y demostró que la cápside AAV7m8 es muy eficiente, y superior a AAV9, para transducir organoides cerebrales humanos. Así, la traslacionabilidad de la investigación preclínica en enfermedades neurológicas podría incrementarse usando organoides cerebrales humanos como modelo complementario a los animales experimentales, especialmente para desarrollar estrategias terapéuticas basadas en transferencia génica mediante AAV. Estudios futuros deberían explorar el potencial de sKL expresado mediante AAV para contrarrestar los síntomas de EA en ratones con déficits cognitivos profundos, mientras que a nivel molecular queda por analizar el efecto de sKL in vivo y en organoides cerebrales humanos.

Alzheimer’s disease (AD), the most common form of dementia, is characterized by the progressive loss of memory and cognitive capacities. The neuropathological hallmarks of AD are deposits of β-amyloid (Aβ) and Tau in the brain, accompanied by neuroinflammation, oxidative stress, impaired autophagy, and neurodegeneration. Although several therapies have been developed targeting Aβ and Tau, today there is still no treatment approved able to cure or prevent AD. The high failure rate of clinical trials may be explained by the multifactorial nature of AD and/or the low translatability of preclinical animal models. Hence, two lines of research arise: on the one hand, to test pleiotropic molecules with the potential to counteract multiple neuropathological processes of AD; on the other hand, to implement preclinical models that better recapitulate the human brain physiology. The anti-aging and neuroprotective protein Klotho (KL) shows promise as a therapeutic candidate given its pleiotropic functions, among others, enhancing cognition, synaptic plasticity and autophagy, protecting from oxidative stress, and reducing neuroinflammation. However, it is still unclear which of the KL variants, the secreted (sKL) or the membrane (mKL), mediates those functions in the human CNS, since most of the research is focused on mKL and mouse models. In this work, the relative gene expression of sKL and mKL was characterized in the human brain, both in healthy and AD conditions. Interestingly, sKL was the most expressed variant in frontal and entorhinal cortex, hippocampus, and amygdala, whereas mKL was predominant in choroid plexus. In mice, mKL was the most abundant, so the expression ratio sKL/mKL is inverted in the mouse brain compared to the human. Besides, during AD, the gene expression of sKL and mKL in brain appeared altered, both in AD patients and 3xTg-AD mice compared to healthy humans and WT mice, respectively. At the protein level, soluble KL in cerebrospinal fluid (CSF) was found significantly lower in AD patients with Mild Dementia. We also observed a positive correlation of KL levels with age in the AD elderly, which was not found in healthy individuals. Besides, the carriers of the APOE4 allele, a major genetic risk factor of AD, presented significantly lower levels of KL in CSF. Based on our findings in humans, we focused on exploring the potential of sKL to counteract the cognitive deficits in AD. Thus, we administered AAV9-sKL vectors into brain of two AD mouse models (3xTg-AD and APP/Tau) to express sKL and assess its effect on cognition through behavioral tests. AAV9-mediated sKL expression tended to improve the spatial learning and the reference memory in 3xTg-AD females and APP/Tau males (assessed by the MWM test), as well as the recognition and spatial memory in APP/Tau and WT females (by NOR and T-maze tests). Unfortunately, both AD mouse models lacked profound memory and cognitive deficits at the ages tested, so the effect of sKL on the behavior assessed by the tests was mild. Finally, this work also highlights the feasibility of human brain organoids as a preclinical model for AAV-based gene therapy research. An AAV-transduction protocol was optimized and the AAV7m8 capsid variant demonstrated to be highly efficient and superior to AAV9 for transducing human brain organoids. Thus, the translatability of preclinical research in neurological diseases could be increased by using human brain organoids as a complementary model to experimental animals, particularly the development of therapeutic strategies based on AAV-mediated gene transfer. In future studies the potential of AAV-mediated sKL expression to counteract AD-related symptoms should be explored in AD-mice developing profound cognitive deficits, while at a molecular level, the effect of AAV-mediated sKL expression remains to be analyzed in vivo and in human brain organoids.