In vitro-produced bovine embryos: different approaches to optimise their vitrification

Abstract

Els programes de cria estan incorporant biotecnologies reproductives per tal de facilitar una activitat ramadera més productiva i sostenible. En concret, la producció in vitro (IVP) d’embrions permet accelerar la millora genètica i eludir problemes dels criadors com la disminució de la fertilitat de les vaques durant els períodes d’estrès per calor. Per a emmagatzemar l’excedent d’embrions de PIV després de la seua transferència a les receptores, així com per a facilitar la difusió de la genètica superior i el comerç mundial garantint al mateix temps el benestar animal i la bioseguretat, la crioconservació d’embrions de PIV s’erigeix com una tècnica clau. Mentre que la congelació lenta tradicional ha demostrat la seua eficàcia per a la crioconservació d’embrions in vivo, les tècniques de vitrificació semblen ser més eficients per als embrions PIV. No obstant això, les seues aplicacions pràctiques en reproducció veterinària són limitades perquè la vitrificació presenta diversos inconvenients. D’una banda, la falta d’un protocol estàndard amb taxes de gestació acceptables després de la transferència d’embrions rescalfats ha restringit l’ús d’aquests en els sistemes de producció ramadera. Per un altra, encara que la vitrificació és més senzilla, ràpida i barata que la congelació lenta, requereix l’ús d’un estereomicroscopi i, quan es treballa en condicions de camp, el procediment és tècnicament exigent. L’objectiu d’aquesta Tesi Doctoral és desenvolupar diferents enfocaments per a optimitzar la vitrificació de blastocists bovins PIV. Consisteixen en modificacions del protocol de vitrificació (1ª i 5ª), dels mitjans de vitrificació (2ª i 3ª) i de l’estructura cel·lular de l’embrió (4ª); i es van desenvolupar utilitzant tant el mètode estàndard (Cryotop) com un mètode adaptat a la granja (VitTrans). En primer lloc, es van comparar dos protocols d’equilibri per a optimitzar la vitrificació i el reescalfament en palleta d’embrions bovins IVP. Per a això, els blastocists expandits de Dia 7 (D7) i Dia 8 (D8) es van assignar aleatòriament a un protocol d’equilibrat llarg (LE; 12 min) i a un altre d’equilibrat curt (SE; 3 min) utilitzant el dispositiu VitTrans per al rescalfament en palleta en un sol pas. Després del rescalfament, els embrions vitrificats amb SE van mostrar una capacitat d’eclosió, un recompte cel·lular total (TCN) i un nombre de cèl·lules de la massa cel·lular interna (ICM) i del trofectoderm (TE) similars als dels blastocists frescos no vitrificats. A més, les taxes d’apoptosis (AR) dels blastocists supervivents del grup SE van ser inferiors a les del grup LE, mentre que es va observar una major abundància del gen antiapoptòtic BCL2 i del gen de la superòxid dismutasa SOD1 en els blastocists SE en comparació amb els de LE. En el segon estudi, es va avaluar el paper crioprotector d’un exopolisacàrid bacterià (EPS) produït pel bacteri antàrtic Pseudomonas sp. ID1 en la vitrificació d’embrions bovins IVP amb Cryotop. Es van vitrificar blastocists expandits de D7 i D8 derivats d’oòcits de vaca o vedella utilitzant un protocol d’equilibri més curt sense suplementació (EPS0) o suplementats amb 10 µg/ml (EPS10) o 100 µg/ml (EPS100) de EPS ID1. Els efectes beneficiosos d’afegir 100 µg/ml de EPS ID1 als mitjans de vitrificació es van observar en les majors taxes de re-expansió i eclosió després de 24 h post-calfament dels blastocists EPS100 en comparació amb els grups EPS0 o EPS10, independentment de la duració del cultiu o de la font d’oòcits. A més, encara que la AR va ser major en tots els grups vitrificats, els blastocists EPS100 de vaca i vedella de D7 i D8 tenien un nombre menor de cèl·lules apoptòtiques que els grups EPS0 o EPS10. El gen proapoptòtic BAX va augmentar en els blastocistos de vaca EPS0, mentre que EPS100 va restablir els nivells de BAX als del grup de control Fresc. En tercer lloc, també es van examinar els efectes beneficiosos d’EPS100, però utilitzant el protocol d’equilibrat curt i el mètode de vitrificació/rescalfament en palleta VitTrans. Per a això, es van vitrificar/rescalfar blastocists expandits de D7 en els grups EPS0 o EPS100, mentre que els blastocists vitrificats pel mètode Cryotop i els blastocists Frescs no vitrificats es van utilitzar com a controls. El tractament EPS100 amb VitTrans va produir taxes de re-expansió similars a les del grup de control Cryotop i una capacitat d’eclosió similar a la dels controls Cryotop i Fresc. A més, es va observar una menor expressió del gen proapoptòtic BAX i majors nivells de la glutatió peroxidasa GPX1 i conexina CDX2 en els blastocists vitrificats/rescalfats amb EPS100 en comparació amb els del grup no suplementat. En quart lloc, es va provar el fluid blastocèlic com a font d’ADN lliure de cèl·lules (cfDNA) i es va comparar amb la biòpsia de TE per microbisturí en termes d’eficàcia/precisió del sexatge. A més, els efectes tant de l’aspiració del fluid del blastocel com de la biòpsia del TE van ser mesurats en la supervivència i la expressió gènica embrionàries. Els blastocists expandits de D7 van ser vitrificats/rescalfats amb el mètode Cryotop d’equilibrat curt en la seua forma intacta (VIT-Control), després del col·lapse del blastocel i l’aspiració del fluid blastocèlic (VIT-Colapsed) i després de la biòpsia del TE (VIT-Biopsied). Aquest estudi va demostrar que existeix cfDNA amplificable i ofereix material genètic fiable per al sexatge, evitant així procediments invasius com la biòpsia de TE per microbisturí. A més, el col·lapse artificial ofereix un potent enfocament per a la criopreservació d’embrions perquè millora la re-expansió post-recalfament i els rendiments d’eclosió i la expressió de gens de qualitat com el gen antiapoptòtic BCL2 en comparació amb la vitrificació/rescalfament d’embrions intactes (VIT-Control) i biopsiats (VIT-Biopsied). Finalment, en el cinquè estudi, es van proposar temps d’equilibri optimitzats basats en prediccions in silico i observacions osmòtiques in vitro a diferents temperatures (25 °C; 38,5 °C) i es van provar utilitzant-los en la vitrificació/rescalfament. Per a això, es van registrar blastòcits del D7 col·lapsats artificialment per a observar els seus canvis volumètrics primer en resposta al dimetilsulfòxid (Me2SO) i etilenglicol (EG), per a modelar la permeabilitat de la membrana, i després a la solució d’equilibri (ES; 7,5% Me2SO i 7,5% EG), per a observacions in vitro. Després de comprovar que les prediccions in silico i les observacions in vitro coincidien, es va utilitzar el protocol d’equilibri per a 25 °C (VIT25; 8 min i 30 s) i per a 38,5 °C (VIT38,5; 3 min i 40 s) per a la vitrificació/calfament dels blastocists col·lapsats del D7. No es van observar diferències estadístiques en la reutilització dels blastocists. No es van observar diferències estadístiques en les taxes de re-expansió a les 24 h post-rescalfament de tots els blastocists vitrificats/escalfats i les del control Fresc, mentre que les taxes d’eclosió van ser significativament superiors en VIT38.5. Els recomptes de cèl·lules TCN i ICM van ser similars en els blastocists del control Fresc i VIT38.5, mentre que el menor recompte de cèl·lules ICM i la major AR es van observar en els blastocists VIT25. En conjunt, els resultats d’aquesta Tesi Doctoral podrien contribuir a l’avanç de la criopreservació d’embrions IVP mitjançant la proposta de diferents estratègies per a millorar els resultats i la factibilitat de la vitrificació. Els resultats aquí presentats podrien contribuir a delimitar un protocol estàndard de vitrificació d’embrions bovins IVP que permetin la seua aplicació a condicions de camp i ofereixin taxes de gestació acceptables.

Los programas de cría están incorporando biotecnologías reproductivas para facilitar una actividad ganadera más productiva y sostenible. En concreto, la producción in vitro (IVP) de embriones permite acelerar la mejora genética y eludir problemas de los criadores como la disminución de la fertilidad de las vacas durante los periodos de estrés por calor. Para almacenar el excedente de embriones de IVP después de su transferencia a las receptoras, así como para facilitar la difusión de la genética superior y el comercio mundial garantizando al mismo tiempo el bienestar animal y la bioseguridad, la crioconservación de embriones de IVP se erige como una técnica clave. Mientras que la congelación lenta tradicional ha demostrado su eficacia para la crioconservación de embriones in vivo, las técnicas de vitrificación parecen ser más eficientes para los embriones IVP. Sin embargo, sus aplicaciones prácticas en reproducción veterinaria son limitadas porque la vitrificación presenta varios inconvenientes. Por un lado, la falta de un protocolo estándar con tasas de gestación aceptables después de la transferencia de embriones recalentados ha restringido el uso de estos en los sistemas de producción ganadera. Por otro, aunque la vitrificación es más sencilla, rápida y barata que la congelación lenta, requiere el uso de un estereomicroscopio y, cuando se trabaja en condiciones de campo, el procedimiento es técnicamente exigente. El objetivo de esta Tesis Doctoral es desarrollar diferentes enfoques para optimizar la vitrificación de blastocistos vacunos IVP. Consisten en modificaciones del protocolo de vitrificación (1ª y 5ª), de los medios de vitrificación (2ª y 3ª) y de la estructura celular del embrión (4ª); y se desarrollaron utilizando tanto el método estándar (Cryotop) como un método adaptado a la granja (VitTrans). En primer lugar, se compararon dos protocolos de equilibrio para optimizar la vitrificación y el recalentamiento en pajuela de embriones vacunos IVP. Para ello, los blastocistos expandidos de Día 7 (D7) y Día 8 (D8) se asignaron aleatoriamente a un protocolo de equilibrado largo (LE; 12 min) y a otro de equilibrado corto (SE; 3 min) utilizando el dispositivo VitTrans para el recalentamiento en pajuela en un solo paso. Después del recalentamiento, los embriones vitrificados con SE mostraron una capacidad de eclosión, un recuento celular total (TCN) y un número de células de la masa celular interna (ICM) y del trofectodermo (TE) similares a los de los blastocistos frescos no vitrificados. Además, las tasas de apoptosis (AR) de los blastocistos supervivientes del grupo SE fueron inferiores a las del grupo LE, mientras que se observó una mayor abundancia del gen antiapoptótico BCL2 y del gen de la superóxido dismutasa SOD1 en los blastocistos SE en comparación con los de LE. En el segundo estudio, se evaluó el papel crioprotector de un exopolisacárido bacteriano (EPS) producido por la bacteria antártica Pseudomonas sp. ID1 en la vitrificación de embriones vacunos IVP con Cryotop. Se vitrificaron blastocistos expandidos de D7 y D8 derivados de oocitos de vaca o ternera utilizando un protocolo de equilibrio corto sin suplementación (EPS0) o suplementado con 10 µg/ml (EPS10) o 100 µg/ml (EPS100) de EPS ID1. Los efectos beneficiosos de añadir 100 µg/ml de EPS ID1 a los medios de vitrificación se observaron en las mayores tasas de re-expansión y eclosión después de 24 h post-recalentamiento de los blastocistos EPS100 en comparación con los grupos EPS0 o EPS10, independientemente de la duración del cultivo o de la fuente de oocitos. Además, aunque la AR fue mayor en todos los grupos vitrificados, los blastocistos EPS100 de vaca y ternera de D7 y D8 tenían un número menor de células apoptóticas que los grupos EPS0 o EPS10. El gen proapoptótico BAX aumentó en los blastocistos de vaca EPS0, mientras que EPS100 restableció los niveles de BAX a los del grupo de control Fresco. En tercer lugar, también se examinaron los efectos beneficiosos de EPS100, pero utilizando el protocolo de equilibrado corto y el método de vitrificación/rescalfament en pajita VitTrans. Para lo cual, se vitrificaron/recalentar blastocistos expandidos de D7 en los grupos EPS0 o EPS100, mientras que los blastocistos vitrificados por el método Cryotop y los blastocistos Frescos no vitrificados se utilizaron como controles. El tratamiento EPS100 con VitTrans produjo tasas de re-expansión similares a las del grupo de control Cryotop y una capacidad de eclosión similar a la de los controles Cryotop y Fresco. Además, se observó una menor expresión del gen proapoptótico BAX y mayores niveles de la glutatión peroxidasa GPX1 y conexina CDX2 en los blastocistos vitrificados/recalentados con EPS100 en comparación con los del grupo no suplementado. En cuarto lugar, se probó el fluido blastocélico como fuente de ADN libre de células (cfDNA) y se comparó con la biopsia de TE por microbisturí en términos de eficacia/precisión del sexado. Además, los efectos tanto de la aspiración del fluido blastocélico como de la biopsia del TE fueron medidos en la supervivencia y la expresión génica embrionarias. Los blastocistos expandidos de D7 fueron vitrificados/recalentados con el método Cryotop de equilibrado corto en su forma intacta (VIT-Control), después del colapso del blastocele y la aspiración del fluido blastocélico (VIT-Colapsed) y después de la biopsia del TE (VIT-Biopsied). Este estudio demostró que existe cfDNA amplificable y ofrece material genético fiable para el sexado, evitando así procedimientos invasivos como la biopsia de TE por microbisturí. Además, el colapso artificial ofrece un potente enfoque para la criopreservación de embriones porque mejora la reexpansión post-recalentamiento y los rendimientos de eclosión y la expresión de genes de calidad como el gen antiapoptótico BCL2 en comparación con la vitrificación/recalentamiento de embriones intactos (VIT-Control) y biopsiados (VIT-Biopsied). Finalmente, en el quinto estudio, se propusieron tiempo de equilibrio optimizados basados en predicciones in silico y observaciones osmóticas in vitro a diferentes temperaturas (25 °C; 38,5 °C) y se probaron utilizándolos en la vitrificación/recalentamiento. Para ello, se registraron los cambios volumétricos de blastocitos D7 colapsados artificialmente primero en respuesta al dimetilsulfóxido (Me2SO) y etilenglicol (EG), para modelar la permeabilidad de la membrana, y después a la solución de equilibrio (ES; 7,5% Me2SO y 7,5% EG), para observaciones in vitro. Después de comprobar que las predicciones in silico coincidían con el comportamiento in vitro, se utilizó el protocolo de equilibrio para 25 °C (VIT25; 8 min y 30 s) y para 38,5 °C (VIT38,5; 3 min y 40 s) para la vitrificación/calentamiento de los blastocistos colapsados de D7. No se observaron diferencias estadísticas en la reutilización de los blastocistos. No se observaron diferencias estadísticas en las tasas de re-expansión a las 24 h post-recalentamiento de todos los blastocistos vitrificados/recalentados y las del control Fresco, mientras que las tasas de eclosión fueron significativamente superiores en VIT38.5. Los recuentos de células TCN y ICM fueron similares en los blastocistos del control Fresco y VIT38.5, mientras que el menor recuento de células ICM y la mayor AR se observaron en los blastocistos VIT25. En conjunto, los resultados de esta Tesis Doctoral podrían contribuir al avance de la criopreservación de embriones IVP mediante la propuesta de diferentes estrategias para mejorar los resultados y la factibilidad de la vitrificación. Los resultados aquí presentados podrían contribuir a delimitar un protocolo estándar de vitrificación de embriones vacunos IVP que permitan su aplicación a condiciones de campo y ofrezcan tasas de gestación aceptables.

Breeding programs are incorporating reproductive biotechnologies to facilitate more productive and sustainable cattle production. In particular, in vitro production (IVP) of embryos allow to accelerate genetic improvement and circumvent breeders’ problems such as decreased cow fertility during heat stress periods. To store surplus IVP embryos after transfer to the recipients, as well as to facilitate dissemination of superior genetics and global trading while ensuring animal welfare and biosecurity, IVP embryo cryopreservation stands a key technique. Whereas traditional slow freezing has proved successful for the cryopreservation of in vivo-derived, vitrification techniques seem to be more efficient for IVP embryos. However, their practical applications in veterinary reproduction are limited because vitrification presents several drawbacks. On the one hand, the lack of a standard protocol with acceptable pregnancy rates after warmed embryo transfer has restricted the use of these embryos in cattle production systems. On the other, although vitrification is simpler, faster, and cheaper than slow freezing, it requires the use of a stereomicroscope and when working under field conditions, the procedure is technically demanding. The objective of this PhD Dissertation is to develop different approaches to optimize bovine IVP blastocyst vitrification. They consist of modifications to the vitrification protocol (1st and 5th), to the vitrification media (2nd and 3rd) and to the embryo cellular structure (4th); and they were developed using both the standard (Cryotop) and a farm-adapted method (VitTrans). First, two equilibration protocols were compared to optimize the vitrification and in-straw warming of IVP bovine embryos. For that, Day 7 (D7) and Day 8 (D8) expanded blastocysts were randomly allocated to long equilibration (LE; 12 min) and short equilibration (SE; 3 min) using the VitTrans device for one-step in-straw warming. After vitrification, D7 and D8 embryos vitrified after SE produced showed similar hatching ability, total cell count (TCN), and inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) cell number than fresh non-vitrified blastocysts. Moreover, apoptosis rates (AR) of surviving blastocysts from SE group were lower than LE group, whereas a higher abundance of the antiapoptotic gene BCL2 and the superoxide dismutase gene SOD1 were found in the SE blastocysts compared to LE. In the second study, the cryoprotectant role of a bacterial exopolysaccharide (EPS) produced by the Antarctic bacteria Pseudomonas sp. ID1 was assessed in the vitrification of IVP bovine embryos with Cryotop. D7 and D8 expanded blastocysts derived from cow or calf oocytes were vitrified using shorter equilibration protocol without supplementation (EPS0) or supplemented with 10 µg/mL (EPS10) or 100 µg/mL (EPS100) of EPS ID1. The beneficial effects of adding 100 µg/mL EPS ID1 to the vitrification media was observed at the higher re-expansion and hatching rates after 24 h post-warming of EPS100 blastocysts compared to EPS0 or EPS10 groups, regardless of culture length or oocyte source. In addition, although the AR was higher in all vitrified groups, D7 and D8 EPS100 blastocysts from cow and calf had a lower number of apoptotic cells than EPS0 or EPS10 groups. Proapoptotic gene BAX was increased in EPS0 cow blastocysts while EPS100 restored BAX levels to those of Fresh control group. Third, the beneficial effects of EPS100 were also examined but using the short equilibration protocol and the vitrification/in-straw warming method VitTrans. With that purpose, D7 expanded blastocysts were vitrified/warmed in EPS0 or EPS100 groups, while blastocysts vitrified by the Cryotop method and fresh non-vitrified blastocysts were used as controls. EPS100 treatment using VitTrans produced similar re-expansion rates to Cryotop control group and similar hatching ability to Cryotop and Fresh controls. Also, a lower expression of proapoptotic gene BAX and higher levels of peroxidase GPX1 and connexin CDX2 were observed in blastocysts vitrified/warmed with.