Development of DNA Detection Bioassays Based on DNA Binding Proteins

Abstract

Les proteïnes d'unió a l'ADN (PUA) són components essencials de molts processos biològics. La seva capacitat de reconèixer i unir-se estretament a l'ADN d'una manera específica o no específica de la seqüència, els converteix en candidats ideals com a elements de bio-reconeixement. Aquest treball explora diferents aplicacions d'aquestes proteïnes en la detecció d'ADN. Es van utilitzar materials sintètics i naturals per immobilitzar les PUA i facilitar la captura i detecció d'ADN objectiu: nanopartícules de carboni (NPC), partícules magnètiques (PM), l'enzim peroxidasa de rave picant (HRP), microplaques i membrana de nitrocel·lulosa (NC). Les proteïnes van ser dissenyades i produïdes de manera recombinant en Escherichia coli. La PUA homodimèrica Cro, amb especificitat de seqüència, del bacteriòfag lambda es va immobilitzar en NPC i es va utilitzar per detectar productes de PCR múltiple amb tires de flux lateral (TFL). Quan es va immobilitzar en PM, es va demostrar que captura, detecta i purifica els amplicons de PCR d'ADN de doble cadena (ADNdc), de manera similar a l amplament establerta estreptavidina-PM, però sense interferències significatives de ADN monocatenari (ADNmc).

immobilitzada en microplaques o en PM es va utilitzar juntament amb HU-HRP per detectar ADNdc sense etiquetar. També es va immobilitzar en NC i es va utilitzar en un TFL amb HU-NPC amb el mateix propòsit. Tots aquests exemples posen de manifest la versatilitat d'aquestes biomolècules i el seu gran potencial en el camp dels biosensors d'ADN. Las proteínas de unión al ADN (PUA) son componentes esenciales de muchos procesos biológicos. Su capacidad para reconocer y unirse estrechamente al ADN de una manera específica o no específica de la secuencia los convierte en candidatos ideales como elementos de bio-reconocimiento. Este trabajo explora diferentes aplicaciones de estas proteínas en la detección de ADN. Se utilizaron materiales sintéticos y naturales para inmovilizar las PUA y facilitar la captura y detección del ADN objetivo: nanopartículas de carbono (NPC), partículas magnéticas (PM), enzima peroxidasa de rábano picante (HRP), microplacas y membrana de nitrocelulosa (NC). Las proteínas fueron diseñadas y producidas de forma recombinante en Escherichia coli. La PUA homodimérica Cro, con especificidad de secuencia, del bacteriófago lambda se inmovilizó en NPC y se utilizó para detectar productos de PCR multiplex con tiras de flujo lateral (TFL). Cuando se inmovilizó en PM, se demostró que captura, detecta y purifica amplicones de PCR de ADN bicatenario (ADNbc), de manera similar a la ampliamente establecida estreptavidina-PM, pero sin interferencia significativa de ADN monocatenario (ADNmc).

microplacas o en PM se usó junto con HU-HRP para detectar ADNbc no marcado. También fue inmovilizada en NC y utilizada en un TFL con HU-NPC para el mismo propósito. Todos estos ejemplos ponen de relieve la versatilidad de estas biomoléculas y su gran potencial en el campo de los biosensores de ADN. DNA binding proteins (DBPs) are essential components of many biological processes. Their ability to recognize and bind tightly to DNA in a sequence-specific or non-sequence specific manner makes them ideal candidates as biorecognition elements. This work sought to explore different applications for these proteins in DNA detection. Synthetic and natural materials were used to immobilize the DBPs and facilitate target DNA capture and detection: carbon nanoparticles (CNPs), magnetic beads (MB), the horseradish peroxidase (HRP) enzyme, microtiter plates, and nitrocellulose membrane (NC). The proteins were engineered and produced recombinantly in Escherichia coli. The sequence-specific homodimeric Cro DBP from bacteriophage lambda was immobilized on CNPs and was used to detect multiplex PCR products with lateral flow dipsticks (LFDs). When immobilized on MB, it was demonstrated to capture, detect and purify double stranded DNA (dsDNA) PCR amplicons, similarly to the well-established streptavidin-MB, but without significant interference from single stranded DNA (ssDNA). For these applications, the specific DNA binding sequence of the DBP was incorporated in one of the PCR primers.