Molecular mechanisms of Smc5/6 complex function: from ATPase-dependent DNA loading to E3 activities

Abstract

Els cromosomes han de ser manipulats amb compte per mantenir la integritat del genoma. La família de complexos proteics SMC contribueix a organitzar el genoma en llaços de cromatina, utilitzant la seva activitat d'ATPasa per associar-se i plegar els cromosomes durant transaccions crítiques com la transcripció, replicació o segregació cromosòmica. Concretament, el complex Smc5/6 juga un paper fonamental en la reparació i la disjunció de cromosomes. Amb aquesta finalitat, les subunitats principals Smc5 i Smc6 s'associen amb sis elements no SMC (subunitats NSE). Recentment, s'ha demostrat que dues d'elles, Nse5 i Nse6, regulen l'activitat ATPasa del complex. D'altra banda, les subunitats Nse1 i Nse2 contenen dominis de tipus RING amb activitat lligasa E3 d’ubiquitina i SUMO, respectivament. Tanmateix, el coneixement de com es coordinen les tres activitats del complex és limitat. Aquesta tesi aprofundeix en diversos aspectes de l'organització i les activitats bioquímiques del complex Smc5/6 de S. cerevisiae. En primer lloc, mostrem que el subcomplex Nse1/3/4 s’acobla a partir d'interaccions seqüencials i cooperatives al voltant del domini ATPasa de Smc5. Al seu torn, el subcomplex Nse1/3/4, juntament amb interaccions entre les articulacions presents als braços, ajuda a la interacció entre els dominis ATPasa de Smc5 i Smc6. Així mateix, els nostres resultats suggereixen una relació intricada entre els subcomplexes Nse1/3/4 i Nse5/6 per a la seva unió al voltant dels dominis ATPasa. En segon lloc, demostrem que la inhibició de la hidròlisi d'ATP atrapa el complex en l’ADN d'una manera independent de Nse5/6, resultant en una interacció proteïna-ADN prou forta per evitar que Smc5/6 se’n dissociï. In vivo, la inhibició de la hidròlisi d'ATP afecta negativament la viabilitat cel·lular i la segregació cromosòmica, ja que interfereix en la resolució d’estructures d'ADN. En tercer lloc, confirmem que l'activitat de lligasa E3 de SUMO prové exclusivament del domini SP-RING de Nse2, sense cap contribució de Nse5/6, i que l’ADN estimula aquesta activitat. A més, determinem llocs de SUMOïlació dins del complex Smc5/6 mitjançant proteòmica, identificant empremtes de SUMOïlació com a possibles llocs d’unió de Nse5/6, que també han estat predits amb AlphaFold Multimer. Finalment, no aportem evidències d'activitat d'ubiquitinació dependent de Nse1, tot i que mostrem que el complex Smc5/6 promou la formació de cadenes d’ubiquitina de manera independent de Nse1. En resum, la nostra recerca ofereix noves perspectives sobre l'organització del complex Smc5/6 i la regulació de les seves activitats bioquímiques, incloent-hi la unió a l’ADN dependent d'ATP i les funcions de lligasa E3 de SUMO i, potencialment, d’ubiquitina.

Los cromosomas deben ser manipulados cuidadosamente para mantener la integridad del genoma. La familia de complejos proteicos SMC contribuye a estructurar el genoma en lazos de cromatina, utilizando su actividad ATPasa para asociarse y organizar los cromosomas durante transacciones críticas como la transcripción, replicación o segregación. En concreto, el complejo Smc5/6 desempeña roles cruciales en la reparación y disyunción de cromosomas. Para este fin, las subunidades centrales Smc5 y Smc6 se asocian con seis elementos no SMC (subunidades NSE). Recientemente se ha demostrado que dos de ellas, Nse5 y Nse6, regulan la actividad ATPasa del complejo. Por otro lado, las subunidades Nse1 y Nse2 contienen dominios de tipo RING con actividad ligasa E3 de ubiquitina y SUMO, respectivamente. Sin embargo, cómo se coordinan las tres actividades del complejo permanece poco comprendido. Esta tesis profundiza en varios aspectos de la organización y actividades bioquímicas del complejo Smc5/6 de S. cerevisiae. En primer lugar, mostramos que el subcomplejo Nse1/3/4 se ensambla a partir de interacciones secuenciales y cooperativas alrededor del dominio ATPasa de Smc5. A su vez, la interacción entre los dominios ATPasa de Smc5 y Smc6 se sustenta a través de Nse1/3/4 e interacciones entre las articulaciones presentes en los brazos. Además, nuestros resultados sugieren una relación intrincada entre los subcomplejos Nse1/3/4 y Nse5/6 para su ensamblaje alrededor del dominio ATPasa. En segundo lugar, demostramos que la inhibición de la hidrólisis de ATP inmoviliza el complejo en el ADN de manera independiente de Nse5/6, resultando en una fuerte interacción proteína-ADN que evita que Smc5/6 pueda separarse del ADN. In vivo, la inhibición de la hidrólisis de ATP afecta negativamente la viabilidad celular y la segregación de cromosomas al interferir con la resolución de estructuras cromosómicas. En tercer lugar, confirmamos que la actividad ligasa E3 de SUMO proviene únicamente del dominio SP-RING de Nse2, sin ninguna contribución de Nse5/6, y que el ADN estimula la actividad E3. Además, determinamos los sitios de SUMOilación en el complejo Smc5/6 mediante proteómica, identificando huellas de SUMOilación como posibles sitios de unión de Nse5/6 que también han sido predichos por AlphaFold Multimer. Por último, no encontramos evidencias de actividad de ubiquitinación dependiente de Nse1, aunque observamos que el complejo Smc5/6 promueve la formación de cadenas de ubiquitina de manera independiente de Nse1. En resumen, nuestra investigación ofrece nuevas perspectivas sobre la organización del complejo Smc5/6 y la regulación de sus diversas actividades bioquímicas, incluyendo la unión al ADN dependiente de ATP y las funciones de ligasa E3 de SUMO y, potencialmente, de ubiquitina.

Chromosomes must be carefully handled to maintain the integrity of the genome. The SMC family of protein complexes help to organize the genome into chromatin loops, using their inherent ATPase activity to associate and fold chromosomes during critical transactions such as transcription, replication, or chromosome segregation. Specifically, the Smc5/6 complex plays pivotal roles in chromosome disjunction and repair. To this end, the core Smc5 and Smc6 subunits associate with six extra non-SMC elements (NSE subunits). Two of them, Nse5 and Nse6, have been recently shown to regulate the ATPase activity of the complex. On the other hand, the Nse1 and Nse2 subunits contain RING-type domains with ubiquitin and SUMO E3 ligase activity, respectively. Nevertheless, how the three activities embedded in the complex are coordinated remains poorly understood. This thesis delves into various aspects of the molecular organization and biochemical activities of the budding yeast Smc5/6 complex. First, we show that the Nse1/3/4 subcomplex is assembled from sequential and cooperative interactions around the Smc5 head domain. In turn, the Nse1/3/4 subcomplex, in cooperation with heterodimeric interactions between the joint regions, help to bring together the two head domains in the Smc5/6 complex. In addition, our results suggest an intricate interplay between Nse1/3/4 and Nse5/6 subcomplexes for their final assembly around the head domains. Second, we demonstrate that the inhibition of ATP hydrolysis traps the complex on DNA in an Nse5/6 independent manner, resulting in a tight protein-DNA interaction that renders Smc5/6 molecules unable to slip away from DNA. In vivo, the inhibition of ATP hydrolysis negatively impacts on cell viability and chromosome segregation by interfering with the resolution of DNA junctions. Third, we confirmed that Smc5/6 SUMO E3 ligase activity solely stems from the SP-RING domain of Nse2, with no contribution from the Nse5/6 subcomplex, and with DNA enhancing the E3 activity. Additionally, we used proteomics to reveal SUMO sites within the Smc5/6 complex, identifying SUMOylation footprints as potential binding sites for Nse5/6 that are also predicted by AlphaFold Multimer. Lastly, we found no evidence of Nse1-dependent ubiquitination activity, although we could detect an Nse1-independent poly-ubiquitin chain formation activity associated with the Smc5/6 complex. Overall, our research offers new insights into the molecular organization of Smc5/6 and the regulation of its diverse biochemical activities, including ATP-depending DNA loading, SUMO E3 and potential ubiquitin E3 ligase functions.