Estudio de la interacción de hCNT3 y QDPR como nexo funcional entre la recuperación de nucleósidos y sus vías biosintéticas

Abstract

[spa] Aún queda mucho por conocer sobre la regulación de la función de los transportadores concentrativos de nucleósidos hCNTs. A pesar de que se expresan en muchos tipos de tejidos, su localización no es ubicua y varía según el tipo de transportador. Además, su distribución en la membrana celular tampoco es homogénea y pueden conseguirse principalmente en la membrana apical de los epitelios polarizados, desde donde favorecen el movimiento vectorial de nucleósidos. Esta expresión y ubicación de los hCNTs debe ser finamente regulada en función a los factores ambientales y las necesidades celulares para asegurar la disponibilidad de nutrientes y mantener la homeostasis. Los distintos hCNTs comparten importantes características estructurales y de localización. Sin embargo, que cada uno de ellos tenga diferencias en la especificidad de sustrato abre la posibilidad a que cumplan diferentes papeles en la regulación de los niveles de nucleós(t)idos y que además puedan regularse entre ellos. Por sus características y por estar estrechamente vinculados al salvamento de nucleósidos, como hipótesis de esta tesis se plantea que la expresión de los hCNTs podría responder a cambios metabólicos producto de alteraciones extra- e intracelulares en los niveles de estas moléculas, tal como se ha observado en otros transportadores de nutrientes. Para entender mejor la participación de los hCNTs en la regulación de la disponibilidad nucleósidos es importante conocer las diferentes proteínas con las que podrían establecer interacciones. En nuestro grupo se han identificado proteínas del interactoma de hCNT3 vinculadas al metabolismo de nucleótidos o a alguna de las vías metabólicas que lo alimentan. Con base en estas observaciones se planteó como objetivo principal estudiar el papel de hCNT3 en la regulación del metabolismo de purinas y de pirimidinas, evaluándolo a través de su interacción con otras proteínas vinculadas a estas vías. Para lograrlo, los siguientes objetivos específicos fueron planteados: I. Estudiar la regulación de los transportadores concentrativos de pirimidinas hCNT1 y hCNT3 en respuesta a la modulación del metabolismo de los nucleótidos. II. Estudiar los factores que afectan la interacción y regulación entre hCNT3 y QDPR. III. Estudiar las posibles implicaciones de la patología asociada a la deficiencia de QDPR en el metabolismo de nucleótidos.

[eng] Balanced nucleotide pools are essential to maintain cell integrity. Intracellular purine and pyrimidine availability rely on de novo nucleotide synthesis pathways and salvage reactions. These processes are finely regulated to meet cellular demand s. Concentrative n ucleoside transporters (hCNTs) are responsible for the uptake of nucleosides and play an important role in nucleoside salvage pathways. Among hCNTs, hCNT1 and hCNT3 are high affinity pyrimidine transporters, although hCNT3 can also translocate purines. Regulation of their expression depending on nucleoside availability has been poorly studied. Therefore, our aim was to stud y the effect of metabolic changes linked to purines and pyrimidine availability upon hCNTs regulation . Transcrip tional studies demonstrated that hCNT1 modulation in response to nucleotide metabolic stress stimulus might be related to its transceptor function. However, hCNT3 expression is determined by the presence of hCNT1. Furthermore, nucleotide metabolism relies on the formation of protein complexes and on protein interactions with enzymes from different metabolic pathways. Therefore, we studied hCNT3 interaction with quinoid dihydropteridine reductase (QDPR), previously identified in our laboratory as a hCNT3 par tner . Since QDPR prevents tetrahydrofolate THF degradation , we hypothesized that the functional relationship between these two proteins could connect hCNT3 to folate metabolism and nucleotide metabolism regulation. Our results showing upregulation of hCN T3 by QDPR pointed toward that direction. In addition, interaction studies using a NanoBRET approach determined that QDPR and hCNT3 interaction can be modulated by the imbalance of intracellular nucleoside and not by extracellular nucleoside availability. QDPR deficiency is characterized by hyperphenylalaninemia and causes neurological disorders. We studied two cases of QDPR deficiency, cause d by different QDPR variants. The first one, with the c.44T>C (p.V15A) variant, presented QDPR low activity and unalt ered urinary pyrimidine levels. The second one c.295+2_295+3delTG / c.68G>A (p.G23D) variant, presented undetectable activity and altered urinary pyrimidine levels. These alterations suggest a fun c tional link between hCNT3 and QDPR deficiency. We demonstra ted that QDPR activity protecting THF from degradation conditions hCNT3 and QDPR interaction These results suggest that hCNT3 plays a role in the etiology of QDPR deficiency. Our data suggests that the functional link between hCNT3 and QDPR is related to nucleoside and folate intracellular pools.