Shedding light on Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli biofilms: from characterisation to new treatments

Abstract

[spa] Las biopelículas son un gran problema sanitario mundial debido a su inherente tolerancia a los tratamientos antimicrobianos. Aunque algunas de ellas son monomicrobianas, muchas otras son comunidades polimicrobianas, en las que se incluyen ciertas infecciones humanas. Los mecanismos subyacentes a la formación de biopelículas no se conocen del todo, y muchos genes de virulencia o incluso genes de resistencia a los antimicrobianos pueden estar implicados en este proceso. La identificación de nuevos genes que podrían estar asociados a la formación de biopelículas, así como el descubrimiento de nuevas moléculas para inhibirlos o erradicarlos es actualmente un objetivo prioritario en investigación. Por ello, esta tesis se centra en el estudio de la formación de biopelículas desde diferentes ángulos. En primer lugar, hemos analizado las interacciones entre especies bacterianas en las infecciones del tracto urinario, concretamente en la biopelícula formada por K. pneumoniae y E. faecalis, encontrando una interacción antagónica entre ellas debido a la produccion de ácido láctico por parte de E. faecalis. Dicho antagonismo se observó al utilizar caldo tripticasa de soja u orina humana enriquecidos con glucosa. Sin embargo, interacciones neutras fueron observadas cuando el medio en el que la biopelícula se desarrolló no contenía glucosa. Estos hallazgos nos llevan a seguir investigando a las bacterias lácticas como posibles agentes de control biológico de la formación de biopelículas en los catéteres permanentes en el contexto de las infecciones del tracto urinario. En segundo lugar, hemos buscado nuevos genes implicados en la formación de biopelículas en E. coli mediante el uso de mutagénesis aleatoria por inserción de un transposón. En la mutante denominada Tn263, el transposón se insertó en el gen purL, que codifica la 5'-fosforibosil-formil-glicinamida amidotransferasa, implicada en la vía biosintética de novo de las purinas. Los análisis de las cepas Tn263, ¿purL::cat y ¿purL/purL+ mostraron que ¿purL::cat, al igual que la mutante Tn263, también había perdido la capacidad de formar biopelículas y dio lugar a colonias de color rosa claro asociadas a fenotipos de curli defectuosos en agar rojo congo. La cepa complementada ¿purL/purL+ mostró valores de absorbancia similares a los de la cepa salvaje y restauró su capacidad de formar fimbrias curli y biopelículas. Además, las cepas Tn263 y ¿purL::cat recuperaron su capacidad de formar biopelículas cuando se añadió inosina monofosfato al medio. Estos resultados demuestran el papel crucial del gen purL y de la vía de biosíntesis de purinas en la producción de curli y, por tanto, en la producción de biopelículas. Así, podemos afirmar que los genes involucrados en las vías biosintéticas de los nucleótidos pueden ser excelentes objetivos para potenciales compuestos antibiopelícula. En nuestro siguiente objetivo, investigamos una nueva molécula de origen natural con actividad proteolítica que podría considerarse en el futuro para tratar las biopelículas formadas por bacterias Gram negativas y Gram positivas. Este extracto de fruta demostró tener actividades antimicrobiana y antibiopelícula, así como efecto bactericida a 2x CMI y 4x CMI tras 24 horas de incubación. Sin embargo, el valor IC50 obtenido mediante el ensayo de XTT en células Jurkat, fue impreciso debido a la viscosidad y turbidez del extracto de fruta. Aunque los valores de CMI obtenidos (que oscilaron entre 35 mg/mL y 50 mg/mL) y MBEC (que oscilaron entre 150 mg/mL y 400 mg/mL) son alentadores, estos valores podrían mejorarse si pudiéramos probar la molécula activa del extracto en nuestras cepas. Una vez conseguido esto, el extracto de fruta con enzimas proteolíticas podría ser un nuevo y prometedor agente antimicrobiano y antibiopelícula. Por último, hemos analizado si el origen de las cepas, los perfiles de resistencia a los antimicrobianos o la presencia o ausencia de diferentes determinantes de virulencia en una colección de cepas de E. coli y K. pneumoniae podrían estar relacionados con su capacidad para formar biopelículas. En el análisis realizado con las cepas de K. pneumoniae, encontramos que las fimbrias y la enterobactina están presentes en prácticamente todas las cepas clínicas analizadas. También encontramos el gen rmpA y el fenotipo hipermucoviscoso en una proporción significativa en nuestro estudio. Como se ha observado en estudios anteriores, observamos una prevalencia considerable de genes codificadores de yersiniabactina entre los aislados del tracto respiratorio, lo que confirma el papel crucial de la yersiniabactina en las infecciones pulmonares. Además, encontramos una asociación estadísticamente significativa entre el gen asociado a la cápsula uge y el origen de los aislados, con la mayoría de los aislados procedentes de orina portando este gen. Al analizar si la existía correlación entre la formación de biopelículas y el origen de los aislados, observamos que las cepas de orina formaban más biopelículas que los aislados del torrente sanguíneo o del tracto respiratorio y adicionalmente, las cepas de origen urinario eran más productoras de betalactamasas que las cepas respiratorias o sanguíneas. En cuanto a los resultados observados en el análisis de las cepas de E. coli, los perfiles de resistencia a los antimicrobianos en nuestra colección mostraron los mayores porcentajes de resistencia con ciprofloxacina, trimetoprim-sulfametoxazol y ampicilina, y encontramos un porcentaje significativo de cepas con genes que codifican Betalacatamasas de espectro extendido, siendo blaCTX-M-15 la más común. En cuanto a la clasificación por grupos filogenéticos, los aislados pertenecientes a los grupos filogenéticos B2 y D tenían una mayor capacidad de formación de biopelículas que los demás grupos filogenéticos. También encontramos una correlación estadísticamente significativa entre la formación de biopelículas y la presencia de varios sideróforos, adhesinas o toxinas. Uno de los hallazgos más notables de nuestro estudio fue la relación estadísticamente significativa entre los genes que codifican colibactina y la formación de biopelículas. En nuestro estudio, se encontró un gran porcentaje de cepas de E. coli positivas para colibactina, la mayoría de ellas formadoras de biopelículas, pertenecientes al grupo filogenético B2, con una tasa de resistencia a los antimicrobianos bastante baja, una gran diversidad clonal y una alta relación con la mayoría de los factores de virulencia estudiados. El papel de la colibactina en las biopelículas y su importancia en diversas enfermedades infecciosas humanas requiere más investigación. Las biopelículas formadas por E. coli y otros patógenos prioritarios también requieren más estudios, ya que en este proceso pueden intervenir factores ambientales u otros factores genéticos aún no identificados.