Structural biology of α-synuclein toxic oligomers: Design of peptide ligands and architecture elucidation

Abstract

L’agregació de l’alfa-sinucleïna (αS) és la principal característica neurològica d’un grup de trastorns neurodegeneratius debilitants, coneguts col·lectivament com a sinucleinopaties, dels quals la malaltia de Parkinson és la més freqüent. Els oligòmers poblats durant els primers esdeveniments de l’agregació d’αS son elements patogènics clau tant per l’inici com la progressió de la malaltia, i per tant son considerats dianes privilegiades per a la intervenció terapèutica i el diagnòstic d’aquestes malalties. Malauradament, l’estructura dels oligòmers de αS i les bases moleculars que dirigeixen la seva conversió a fibres son encara desconegudes, impedint el disseny racional d’estratègies que tinguin els oligòmers com diana. En aquesta tesi, hem aprofitat les principals propietats fisicoquímiques compartides entre els oligòmers i les fibres d’αS per identificar una família de pèptids helicoïdals que s’uneixen amb alta afinitat i selectivitat conformacional a aquestes espècies patogèniques d’αS. Aquests pèptids tenen el potencial d’inhibir l’agregació d’aquesta proteïna i eliminar el dany cel·lular associat als oligòmers, sense interaccionar amb els monòmers funcionals d’αS. Aquestes propietats, els converteixen en eines prometedores per al diagnòstic i tractament d’aquestes malalties. Cal destacar que un d’aquests pèptids, LL-37, s’expressa de manera constitutiva en humans en teixits rellevants per la malaltia, suggerint que aquest o altres pèptids endògens similars poden tenir un paper rellevant en el control de la l’agregació d’αS a nivell fisiològic.

A més, hem fet valdre la interacció d’aquestes pèptids per poder desxifrar les característiques estructurals dels oligòmers. La unió de pèptids als oligòmers en redueix la seva flexibilitat i heterogeneïtat conformacional, permetent assolir una caracterització estructural més detallada. Aquesta aproximació ens ha permès determinar per primera vegada la simetria i l’arquitectura d’un oligòmer d’αS arribant a poder disseccionar les propietats conformacionals de les seves cadenes individuals. També hem identificat una regió curta al N-terminal de l’ αS fonamental per a la conversió dels oligòmers a fibres. La mutació familiar G51D, associada al desenvolupament primerenc de la malaltia de Parkinson, afecta la conformació d’aquesta regió, provocant una acumulació d’oligòmers resistents a la maquinària de desagregació de Hsp70.

Globalment, els nostres resultats revelen noves característiques estructurals i mecanístiques dels oligòmers d’αS i construeixen un nou marc estructural i biofísic per al desenvolupament de noves estratègies terapèutiques i de diagnòstic per a la malaltia de Parkinson i altres sinucleinopaties.

La agregación de la alfa-sinucleína (αS) es la principal característica neurológica de un grupo de trastornos neurodegenerativos debilitantes, conocidos colectivamente como sinucleinopatías, de los cuales la enfermedad de Parkinson es la más frecuente. Los oligómeros poblados durante los primeros eventos de la agregación de αS son elementos patogénicos clave tanto en el inicio como en la progresión de la enfermedad, y por tanto son considerados dianas privilegiadas para la intervención terapéutica y el diagnóstico de estas enfermedades. Desgraciadamente, la estructura de los oligómeros de αS y las bases moleculares que dirigen su conversión a fibras son todavía desconocidas, impidiendo el diseño racional de estrategias que tengan los oligómeros como diana. En esta tesis, hemos aprovechado las principales propiedades físico-químicas compartidas entre los oligómeros y las fibras de αS para identificar a una familia de péptidos helicoidales que se unen con alta afinidad y selectividad conformacional a estas especies patogénicas de αS. Estos péptidos tienen el potencial de inhibir la agregación de esta proteína y eliminar el daño celular asociado a los oligómeros, sin interaccionar con los monómeros funcionales de αS. Estas propiedades los convierten en herramientas prometedoras para el diagnóstico y tratamiento de estas enfermedades. Cabe destacar que uno de estos péptidos, LL-37, se expresa de forma constitutiva en humanos en tejidos relevantes para la enfermedad, sugiriendo que este u otros péptidos endógenos similares pueden tener un papel relevante en el control de la agregación de αS a nivel fisiológico.

Además, hemos aprovechado la interacción de estos péptidos para poder descifrar las características estructurales de los oligómeros. La unión de estos péptidos a los oligómeros reduce su flexibilidad y heterogeneidad conformacional, permitiendo una caracterización estructural más detallada. Esta aproximación nos ha permitido determinar por primera vez la simetría y la arquitectura de un oligómero de αS, llegando a diseccionar las propiedades conformacionales de sus cadenas individuales. También hemos identificado una región corta en el N-terminal del αS fundamental para la conversión de los oligómeros a fibras. La mutación familiar G51D, asociada al desarrollo temprano de la enfermedad de Parkinson, afecta a la conformación de esta región, provocando una acumulación de oligómeros resistentes a la maquinaria de desagregación de Hsp70.

Globalmente, nuestros resultados revelan nuevas características estructurales y mecanísticas de los oligómeros de αS y construyen un nuevo marco estructural y biofísico para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y de diagnóstico para la enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías.

α-Synuclein (αS) aggregation is the main neurological hallmark of a group of debilitating neurodegenerative disorders, collectively referred to as synucleinopathies, of which Parkinson’s disease is the most prevalent. Oligomers populated during the early events of αS aggregation are considered key pathogenic drivers of disease onset and progression, standing as privileged targets for therapeutic intervention and diagnosis. However, the structure of αS oligomers and the mechanistic basis of oligomer to fibril conversion are yet unknown, precluding the rational design of oligomer-targeting strategies. In this thesis dissertation, we exploited the main shared physicochemical properties of αS oligomers and fibrils to identify a family of α-helical peptides that bind αS pathogenic species with high affinity and conformational selectivity. These peptides have the potential to inhibit protein aggregation and abrogate oligomer associated cellular damage, with non-detectable monomer binding. These properties make them promising tools for disease diagnosis and treatment. Noteworthy, LL-37, one of such peptides, is constitutively expressed in disease-relevant tissues in humans, suggesting that this or similar endogenous peptides may have a physiological role in control protein aggregation.

We then exploited this peptide binding to interrogate oligomer’s structural features. Peptide binding to oligomers reduces their fuzziness and conformational heterogenicity, allowing a more detailed structural characterization. We determined for the first time the symmetry and architecture of an αS oligomer and dissected the conformational properties of individual chains. We also identified a short N-terminal region fundamental for oligomer to fibril conversion. The familial G51D mutation associated with early onset Parkinson’s disease affects the conformational of this region, causing an accumulation of oligomers resistant to the Hsp70 disaggregation machinery.

Overall, our results build a new structural and biophysical framework for oligomer targeting in therapeutics and diagnosis while unveiling new structural and mechanistic features of αS oligomers.