Exploring T-DNA gene mechanisms and optimizing centelloside production in Centella asiatica hairy root cultures

Abstract

[eng] Plant biofactories constitute an eco-friendly alternative to chemical synthesis as they have a lower environmental impact and therefore contribute to a more sustainable future. Hairy root cultures, generated by infecting plant material with Rhizobium rhizogenes, are efficient plant biofactories for producing high-value bioactive plant compounds such as centellosides, which are found in Centella asiatica. An important challenge in plant biotechnology is the sustainable production of centellosides, which have widespread use in dermopharmaceuticals and cosmeceuticals. This PhD thesis aimed to investigate the effects of randomly integrated genes, specifically the rol genes, following R. rhizogenes infection in C. asiatica. The focus was on understanding the significance of changes in morphology and the expression of triterpene biosynthetic genes in hairy root lines to enhance centelloside production. Machine learning models were used to analyze the impact of T-DNA gene expression levels on morphological traits, hormonal profiles, and centelloside contents. The results indicated that a high expression of these genes was associated with increased centelloside production and positively influenced the expression of centelloside biosynthetic genes. Furthermore, we established connections between elevated centelloside levels and isopentenyladenosine, as well as between reduced centelloside content and abscisic acid. Proteomics analysis identified key biomarkers of centelloside production, notably ornithine cyclodeaminase. This biomarker is codified by the rolD gene, previously considered of low importance in hairy root induction, which was found to effect hairy root growth and centelloside content. To improve centelloside yields in high-growth C. asiatica hairy roots, various biotic elicitors were employed. Elicitation with coronatine/methyl jasmonate resulted in the highest total centelloside content, obtained at day 14 of treatment. Elicitation also notably enhanced the expression of centelloside pathway genes, particularly those involved in the final stages, leading to a greater centelloside production. To optimize centelloside yields in C. asiatica hairy roots through metabolic engineering, two transgenes were inserted: a transcription factor TSAR2 and squalene synthase from Arabidopsis thaliana. This resulted in the upregulation of genes involved in the initial steps of the centelloside metabolic pathway, thereby increasing the availability of precursors for an enhanced centelloside production. Some of these precursors were redirected toward phytosterol biosynthesis, leading to morphological changes in the hairy root phenotype and indicating a competitive interaction between the centelloside and phytosterol pathways.

[spa] Las biofactorías de plantas constituyen una alternativa ecológica a la síntesis química, ya que tienen un menor impacto ambiental y, por lo tanto, contribuyen a un futuro más sostenible. Las culturas de raíces transformadas, generadas mediante la infección de material vegetal con Rhizobium rhizogenes, son eficientes biofactorías de plantas para la producción de compuestos bioactivos de alto valor, como los centellósidos, que se encuentran en Centella asiatica. Un desafío importante en biotecnología vegetal es la producción sostenible de centellósidos, que tienen un uso extendido en dermofarmacéuticos y cosmecéuticos. Esta tesis de doctorado tenía como objetivo investigar los efectos de los genes integrados aleatoriamente, específicamente los genes rol, después de la infección de R. rhizogenes en C. asiatica. El trabajo se centró en comprender la importancia de los cambios en la morfología y la expresión de los genes de la biosintesís de triterpenos en líneas de raíces transformadas para mejorar la producción de centellósidos. Se utilizaron modelos de aprendizaje automático para analizar el impacto de los niveles de expresión de genes del T-DNA en los parámetros morfológicos, perfiles hormonales y contenidos de centellósidos. Los resultados indicaron que una alta expresión de estos genes se asoció con un aumento en la producción de centellósidos e influyó positivamente en la expresión de genes biosintéticos de los centellósidos. Además, establecimos conexiones entre los niveles elevados de centellósidos y la isopenteniladenosina, así como entre el contenido reducido de centellósidos y el ácido abscísico. El análisis de proteómica identificó biomarcadores claves de la producción de centellósidos, especialmente la ornitina ciclodeaminasa. Este biomarcador está codificado por el gen rolD, anteriormente considerado de poca importancia en la inducción de raíces transformadas, y se descubrió que afecta al crecimiento de las raíces transformadas y al contenido de centellósidos. Para mejorar los rendimientos de centellósidos en raíces transformadas de alto crecimiento de C. asiatica, se emplearon diversos elicitadores bióticos. La elicitación con coronatina/metil jasmonato resultó en el mayor contenido total de centellósidos, obtenido en el día 14 post-elicitación. La elicitación también mejoró notablemente la expresión de genes de la vía de centellósidos, especialmente aquellos involucrados en las etapas finales, lo que llevó a una mayor producción de centellósidos. Para optimizar los rendimientos de centellósidos en raíces transformadas de C. asiatica a través de la ingeniería metabólica, se insertaron dos transgenes: un factor de transcripción TSAR2 y el escualeno sintasa de Arabidopsis thaliana. Esto resultó en la regulación de la sobreexpresión de los genes involucrados en las etapas iniciales de la vía metabólica de centellósidos, aumentando así la disponibilidad de precursores para una producción mejorada de estos metabolitos secundarios. Algunos de estos precursores se redirigieron hacia la biosíntesis de fitoesteroles, lo que provocó cambios morfológicos en el fenotipo de las raíces transformadas e indicó una interacción competitiva entre las vías de los centellósidos y fitoesteroles.