Targeted biodegradable nanoparticles of simvastatin as new therapeutic tool for chronic liver disease

Abstract

La malaltia hepàtica crònica (MHC) inclou qualsevol estat patològic del fetge caracteritzat per una fibrosi progressiva que condueix a l’aparició de cirrosi hepàtica o MHC avançada, sent una de les seves principals complicacions la hipertensió portal. Existeixen diferents causes que poden induir a una lesió hepàtica, la qual pot ser potencialment mortal en cas d’insuficiència hepàtica, sent necessari en molts casos un trasplantament de fetge. Actualment, existeixen molt pocs tractaments disponibles per a frenar la progressió de la malaltia hepàtica amb hipertensió portal. Una de les classes de fàrmacs més àmpliament estudiades en les últimes dècades són les estatines, que han demostrat ser beneficioses en el context de la MHC, tot i que poden provocar certs efectes adversos en l’àmbit muscular i hepàtic. Per a evitar la toxicitat generada per les estatines en pacients amb aquesta patologia i augmentar-ne el potencial terapèutic, la present tesi doctoral es basa en el desenvolupament de nanopartícules com a sistema d’administració de fàrmacs per a la MHC i el seu estudi en models experimentals de cirrosi. En concret, aquest treball se centra en l’ús de micel·les polimèriques (MP) com a dispositius per a encapsular simvastatina, com estatina de referència, i dirigir-la a les cèl·lules endotelials sinusoidals hepàtiques (LSEC, liver sinusoidal endothelial cells) a causa del paper fonamental que exerceixen aquestes cèl·lules com a sensors i impulsores de la MHC. En aquest sentit, la finalitat és mantenir el fenotip sa de les LSEC per a així preservar la funció hepàtica. La tesi es divideix en dos estudis: en el primer estudi es van avaluar dos tipus de MP basades en els polímers Pluronic® F127 i F108 per a l’administració de simvastatina (MP-Sim), i es van testar en un model de MHC avançada per lligadura del conducte biliar (BDL, bile duct ligation); en el segon estudi la MP-F127 es va funcionalitzar (FMP) mitjançant l’acoblament de lligands peptídics de receptors de membrana de les LSEC (receptors CD32b, CD36 i integrina αVβ3) per a un adreçament actiu de la nanopartícula cap a aquest tipus cel·lular i es va analitzar la seva eficàcia en dos models experimentals de cirrosi hepàtica, el de BDL i el d’inducció tòxica per tioacetamida (TAA). La MP-F127-Sim va mostrar els majors índexs d’internalització cel·lular en LSEC aïllades de rata i una toxicitat significativament menor que la simvastatina lliure, millorant el seu fenotip cel·lular in vitro. La biodistribució in vivo de MP-F127 va ser principalment hepàtica i després d’una setmana d’administració en el model de BDL, la MP-F127-Sim va demostrar un efecte superior al del fàrmac lliure en la reducció de la hipertensió portal sense signes de toxicitat. La funcionalització de MP amb diferents lligands peptídics va resultar en formulacions estables amb un major grau d’internalització in vivo en LSEC que les MP no dirigides. L’administració de FMP-Sim en rates BDL va reduir els nivells de toxicitat muscular i hepàtica respecte a la simvastatina lliure, encara que amb un efecte reductor de la pressió portal moderat. En un model menys greu de cirrosi com l’induït per TAA, el tractament durant dues setmanes amb la nanopartícula FMP-CD32b-Sim va aconseguir rebaixar significativament els valors de pressió portal, la qual cosa es va associar amb un percentatge menor de fibrosi hepàtica, així com a l’estimulació de la síntesi d’òxid nítric. En definitiva, l’ús de MP per a l’administració de simvastatina es postula com una eina segura i eficaç per al maneig de la hipertensió portal en la MHC no descompensada, sent la funcionalització amb el lligand peptídic de CD32b una manera d’optimitzar el seu adreçament específic a les LSEC, millorant el potencial terapèutic de les estatines o d’altres possibles fàrmacs beneficiosos.

La enfermedad hepática crónica (EHC) incluye cualquier estado patológico del hígado caracterizado por una fibrosis progresiva que conduce a la aparición de cirrosis hepática o EHC avanzada, siendo una de sus principales complicaciones la hipertensión portal. Existen diferentes causas que pueden inducir a una lesión hepática, la cual puede ser potencialmente mortal en caso de insuficiencia hepática, siendo necesario en muchos casos un trasplante de hígado. Actualmente, existen muy pocos tratamientos disponibles para frenar la progresión de la enfermedad hepática con hipertensión portal. Uno de los grupos de fármacos más ampliamente estudiados en las últimas décadas son las estatinas, que han demostrado ser beneficiosas en el contexto de la EHC, aunque pueden provocar ciertos efectos adversos a nivel muscular y hepático. Para evitar la toxicidad generada por las estatinas en pacientes con esta patología y aumentar al mismo tiempo su potencial terapéutico, la presente tesis doctoral se basa en el desarrollo de nanopartículas como sistema de administración de fármacos para la EHC y su estudio en modelos experimentales de cirrosis. En concreto, este trabajo se centra en el uso de micelas poliméricas (MP) como dispositivos para encapsular simvastatina, como estatina de referencia, y dirigirla a las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC, liver sinusoidal endothelial cells) debido al papel fundamental que desempeñan estas células como sensores e impulsoras de la EHC. En este sentido, la finalidad es mantener el fenotipo sano de las LSEC para así preservar la función hepática. La tesis se divide en dos estudios: en el primer estudio se evaluaron dos tipos de MP basadas en los polímeros Pluronic® F127 y F108 para administrar simvastatina (MP-Sim), y se testaron en un modelo de EHC avanzada por ligadura del conducto biliar (BDL, bile duct ligation); en el segundo estudio la MP-F127 se funcionalizó (FMP) mediante el acoplamiento de ligandos peptídicos de receptores de membrana de las LSEC (receptores CD32b, CD36 e integrina αVβ3) para un direccionamiento activo de la nanopartícula hacia este tipo celular y se analizó su eficacia en dos modelos experimentales de cirrosis hepática, el de BDL y el de inducción tóxica por tioacetamida (TAA). La MP-F127-Sim mostró los mayores índices de internalización celular en LSEC aisladas de rata y una toxicidad significativamente menor que la simvastatina libre, mejorando su fenotipo celular in vitro. La biodistribución in vivo de MP-F127 fue principalmente hepática y tras una semana de administración en el modelo de BDL, la MP-F127-Sim demostró un efecto superior al del fármaco libre en la reducción de la hipertensión portal sin signos de toxicidad. La funcionalización de MP con distintos ligandos peptídicos resultó en formulaciones estables con un mayor grado de internalización in vivo en LSEC que las MP no dirigidas. La administración de FMP-Sim en ratas BDL redujo los niveles de toxicidad muscular y hepática respecto a la simvastatina libre, aunque con un efecto reductor de la presión portal moderado. En un modelo menos grave de cirrosis como el inducido por TAA, el tratamiento durante dos semanas con la nanopartícula FMP-CD32b-Sim consiguió rebajar significativamente los valores de presión portal, lo que se asoció con un porcentaje menor de fibrosis hepática, así como a la estimulación de la síntesis de óxido nítrico. En definitiva, el uso de MP para la administración de simvastatina se postula como una herramienta segura y eficaz para el manejo de la hipertensión portal en la EHC no descompensada, siendo su funcionalización con el ligando peptídico de CD32b una forma de optimizar su direccionamiento específico hacia las LSEC, mejorando el potencial terapéutico de las estatinas, así como de cualquier combinación beneficiosa de fármacos.

Chronic liver disease (CLD) refers to any pathological state of the liver characterized by the progression from a state of fibrosis to the onset of liver cirrhosis or advanced CLD, one of the main complications being portal hypertension (PH). There are different causes that can induce liver injury, which can be life-threatening in case of liver failure, often requiring liver transplantation. There are currently very few treatments available to slow the progression of liver disease with PH. Statins have been one of the most extensively studied classes of drugs in recent decades, proving to be beneficial in the context of CLD, although causing certain adverse effects at the muscular and hepatic level. To avoid the toxicity generated by statins in patients with this pathology, while increasing their therapeutic potential, this doctoral thesis is based on the development of nanoparticles as a drug delivery system for CLD and their study in experimental models of cirrhosis. Specifically, this work focuses on the use of polymeric micelles (PM) as nanodevices to encapsulate simvastatin, as the reference statin, and target it to liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) due to the fundamental role played by these cells as sensors and drivers of CLD. Thus, the aim is to maintain the LSEC healthy phenotype to preserve the liver function. This thesis is divided into two studies: in the first study, two types of PM based on Pluronic® F127 and F108 polymers were evaluated for simvastatin delivery (PM-Sim) and tested in an advanced CLD model by bile duct ligation (BDL); in the second study, the PM-F127 was functionalized (FPM) by coupling peptide ligands of LSEC membrane receptors (CD32b, CD36 and integrin αVβ3 receptors) for active targeting of the nanoparticle to this cell type, and its efficacy was assessed in two experimental models of liver cirrhosis, by BDL and by thioacetamide (TAA) toxic induction. PM-F127-Sim showed the highest cell internalization rates in isolated rat LSEC and significantly lower toxicity than free simvastatin, improving their cell phenotype in vitro. In vivo biodistribution of PM-F127 was mainly hepatic and after one week of administration in the BDL model, PM-F127-Sim demonstrated a superior effect to free drug in reducing PH with no signs of toxicity. Functionalization of PM with different peptide ligands resulted in stable formulations with a greater degree of in vivo internalization in LSEC than untargeted PM. Administration of FPM-Sim in BDL rats reduced muscle and liver toxicity levels relative to free simvastatin, albeit with a moderate portal pressure lowering effect. In a less severe model of TAA-induced cirrhosis, treatment with the FPM-CD32b-Sim nanoparticle for two weeks significantly decreased portal pressure values, which was associated with a lower percentage of liver fibrosis, as well as stimulation of nitric oxide synthesis. Altogether, the use of PM for simvastatin delivery is postulated as a safe and effective tool for the management of PH in non-decompensated CLD, being its functionalization with the peptide ligand CD32b a way to optimize its specific targeting to LSEC, improving the therapeutic potential of statins. Moreover, this delivery system could be used not only to encapsulate statins, but any beneficial drug or combination of them to improve dysfunctional LSEC.