Deciphering the regenerative response of peripheral neuron subtypes after nerve injury

Abstract

Les neurones perifèriques poden regenerar després d’una lesió nerviosa, però la recuperació funcional sol ser limitada. Després d’una axotomia, les neurones experimenten canvis en l’expressió gènica, passant a un estat pro-regeneratiu que permet la regeneració de l’axó. Malauradament, la manca d’especificitat dificulta la recuperació funcional completa. Com que les neurones perifèriques són molt heterogènies i tenen diferents òrgans diana, els axons sensorials i motors que estan regenerant poques vegades troben les seves vies originals per reinnervar els òrgans adequats. Actualment, no hi ha una estratègia terapèutica eficaç per promoure la regeneració específica de les diferents neurones. Tot i que hi ha una resposta regenerativa comuna entre les neurones, la velocitat i la qualitat de la regeneració poden diferir entre les subpoblacions. Per tant, el patró d’expressió gènica activat després d’una lesió també hauria de ser diferent. En aquesta tesi, el nostre objectiu va ser caracteritzar la resposta intrínseca a una lesió de nervi en quatre poblacions neuronals paradigmàtiques: motoneurones, propioceptors, neurones de tacte i nociceptors. Per això, vam utilitzar ratolins transgènics amb fluorescència en subpoblacions específiques (Cre/Ai9), així com ratolins amb ribosomes modificats en tipus neuronals específics (Cre/Ribotag). Aquesta modificació ens permet aïllar els ribosomes i l’ARNm de la població d’interès. Combinant ambdues estratègies, vam definir el patró d’expressió gènica d’aquestes poblacions després d’una lesió nerviosa en el context de la seva regeneració histològica. En primer lloc, es va validar el marcatge específic de neurones dels ratolins ChAT-Cre/Ai9, PV-Cre/Ai9, Npy2r-Cre/Ai9, TRPV1-Cre/Ai9 i Calb1-Cre/Ai9 en motoneurones, propioceptors, mecanoreceptors cutanis, nociceptors i neurones de tacte, respectivament. Es va veure que aquestes neurones tenien diferents taxes de regeneració in vivo i in vitro, sent els nociceptors els més ràpids i els propioceptors les neurones amb pitjor regeneració. Després d’una secció del nervi femoral, vam trobar que totes les neurones mostraven preferència per regenerar cap a la branca correcta: les motoneurones i els propioceptors van regenerar més a través de la branca muscular, mentre que els mecanoreceptors cutanis van preferir la branca cutània. Tot i que aquesta preferència va ser petita, ens indica l’existència d’un mecanisme d’especificitat que es podria modular per millorar la recuperació funcional. Després d’establir la regeneració histològica, vam investigar els canvis d’expressió gènica després d’un aixafament del nervi ciàtic fent servir els ratolins Ribotag. La seqüenciació de l’ARN va detectar més de 3.000 gens que estaven regulats després de la lesió. D’aquests, més de 800 coincidien a les quatre poblacions, inclosos Gap43, Tubb2a i Jun. Sorprenentment, entre el 75-80 % dels gens expressats diferencialment no es van activar a totes les neurones. Vam veure que alguns d’aquests gens només estaven regulats per neurones musculars (per exemple, L1cam) o per neurones cutànies (per exemple, Gpc2). Les anàlisis d’enriquiment van revelar una activació diferencial en vies rellevants com la de l’ErbB, les semaforines-plexines i els PPAR. A partir de les dades de la seqüenciació, vam triar alguns factors candidats per modular la regeneració específica. Vam veure que el factor NT-3 augmentava les neurites dels propioceptors, mentre que l’NGF i BDNF promovien el creixement de neurites dels nociceptors. Finalment, utilitzant siRNAs, vam disminuir l’expressió de Med12, un gen sobre-regulat específicament en propioceptors axotomitzats. El seu bloqueig va augmentar la longitud de les neurites exclusivament en aquesta població, suggerint que Med12 és un regulador específic de la regeneració. En conclusió, en aquesta tesi es demostra que diferents poblacions neuronals regeneren de manera diferent i activen mecanismes regeneratius diversos. Aquests descobriments ens aporten informació valuosa sobre els mecanismes regeneratius de neurones específiques i estableixen una base per a futurs estudis centrats a promoure la regeneració específica i, per tant, la recuperació funcional després d’una lesió de nervi.

Las neuronas periféricas pueden regenerar después de una lesión nerviosa, pero la recuperación funcional suele ser limitada. Después de una axotomía, las neuronas experimentan cambios en la expresión génica, pasando a un estado pro-regenerativo que permite la regeneración del axón. Desafortunadamente, la falta de especificidad dificulta la recuperación funcional completa. Debido a que las neuronas periféricas son muy heterogéneas y tienen distintos órganos diana, los axones sensoriales y motores que están regenerando rara vez encuentran sus vías originales para reinervar los órganos adecuados. Actualmente, no existe una estrategia terapéutica eficaz para promover la regeneración específica. A pesar de que existe una respuesta regenerativa común entre las neuronas, la velocidad y la calidad de la regeneración pueden diferir entre las subpoblaciones. Por lo tanto, el patrón de expresión génica activado después de una lesión también debería ser diferente. En esta tesis, nuestro objetivo fue caracterizar la respuesta intrínseca a una lesión de nervio en cuatro poblaciones neuronales paradigmáticas: motoneuronas, propioceptores, neuronas de tacto y nociceptores. Para ello, utilizamos ratones transgénicos con fluorescencia en subpoblaciones específicas (Cre/Ai9) y ratones con ribosomas modificados en tipos neuronales específicos (Cre/Ribotag). Esta modificación nos permite aislar los ribosomas y el ARNm de la población de interés. Combinando ambas estrategias, se definió el patrón de expresión génica de estas poblaciones de neuronas después de la lesión nerviosa en el contexto de su regeneración histológica. En primer lugar, se validó el marcaje específico de neuronas de ratones ChAT-Cre/Ai9, PV-Cre/Ai9, Npy2r-Cre/Ai9, TRPV1-Cre/Ai9 y Calb1-Cre/Ai9 en motoneuronas, propioceptores, mecanorreceptores cutáneos, nociceptores y neuronas de tacto, respectivamente. Se vio que estas neuronas tenían diferentes tasas de regeneración in vivo e in vitro, siendo los nociceptores los más rápidos y los propioceptores las neuronas con peor regeneración. Después de una sección del nervio femoral, encontramos que todas las neuronas mostraron preferencia por regenerar hacia la rama correcta: motoneuronas y propioceptores regeneraron más a través de la rama muscular, mientras que los mecanorreceptores cutáneos prefirieron la rama cutánea. A pesar de que esta preferencia fue pequeña, nos indica que existe un mecanismo de especificidad que podría modularse para mejorar la recuperación funcional. Después de establecer la regeneración histológica, investigamos los cambios de expresión génica después de un aplastamiento del nervio ciático usando los ratones Ribotag. La secuenciación del ARN descubrió que más de 3000 genes estaban regulados después de la lesión. De estos, más de 800 coincidieron en las cuatro poblaciones, incluidos Gap43, Tubb2a y Jun. Sorprendentemente, el 75-80 % de los genes expresados diferencialmente no se activaron en todas las neuronas. Vimos que algunos de estos genes solo estaban regulados por neuronas musculares (por ejemplo, L1cam) o por neuronas cutáneas (por ejemplo, Gpc2). Los análisis de enriquecimiento revelaron una activación diferencial en vías relevantes como la del ErbB, la de las semaforinas-plexinas y los PPAR. A partir de los datos de la secuenciación, elegimos algunos factores candidatos para modular la regeneración específica. Vimos que el factor NT-3 aumentaba las neuritas de los propioceptores, mientras que NGF y BDNF promovían el crecimiento de neuritas de nociceptores. Por último, usando siRNAs, disminuimos la expresión de Med12, un gen sobre-regulado específicamente en propioceptores axotomizados. Su bloqueo aumentó la longitud de las neuritas exclusivamente en esta población, sugiriendo que Med12 es un regulador específico de la regeneración. En conclusión, en esta tesis se demuestra que diferentes poblaciones neuronales regeneran de manera distinta y activan mecanismos regenerativos diferentes. Estos hallazgos nos aportan información valiosa sobre los mecanismos regenerativos de neuronas específicas y establecen una base para futuros estudios centrados en promover la regeneración específica y, por lo tanto, la recuperación funcional después de una lesión de nervio.

Peripheral neurons can regenerate after a nerve injury, but functional recovery is usually limited. After an axotomy, neurons undergo several gene expression changes, culminating in a switch to a pro−regenerative state that allows axon regeneration. Unfortunately, lack of specificity in regeneration hinders proper functional outcome. As peripheral neurons are highly heterogeneous and have distinct target organs, regenerating motor and sensory axons rarely find their original pathways to reinnervate appropriate targets. Up to now, there is no effective therapeutic strategy to promote the specific regeneration of different neurons. Although there is a common regenerative response between neurons, the speed and quality of regeneration can differ between subpopulations. Thus, the gene expression pattern activated after an injury should be different too. In this thesis, we aimed to characterize the intrinsic response of neurons to injury in four paradigmatic populations: motoneurons, proprioceptors, touch receptors, and nociceptors. To do so, we used double−transgenic mice that have fluorescence in specific subpopulations (Cre/ Ai9) as well as mice with cell−specific tagged ribosomes (Cre/Ribotag). Combining both strategies, we defined the translatome of these neuron populations after nerve injury within the context of their histological regeneration. We validated the neuron−specific labeling of ChAT−Cre/Ai9, PV−Cre/Ai9, Npy2r−Cre/Ai9, Trpv1−Cre/Ai9, and Calb1−Cre/Ai9 mice in motoneurons, proprioceptors, cutaneous mechanoreceptors, nociceptors, and touch receptors, respectively. We found that these neurons had different regeneration rates in vivo and in vitro, being nociceptors the fastest and proprioceptors the neurons with worst regeneration. After a femoral nerve transection, we found that all neurons show a preference to regenerate toward the correct branch: motoneurons and proprioceptors regenerate more through the muscle branch, whereas cutaneous mechanoreceptors prefer the cutaneous branch. Although small, this preference highlights the existence of a specificity mechanism that could be modulated to promote functional recovery. After establishing the histological regeneration, we investigated the translatome after a sciatic crush using the Ribotag mice. We found that more than 3000 genes were up or downregulated after injury. From these, more than 800 were regulated in the four populations, including Gap43, Tubb2a, and Jun. Interestingly, 75−80% of the differentially expressed genes were not commonly activated by all neurons. Some were only regulated by muscle neurons (e.g. L1cam) or by cutaneous neurons (e.g. Gpc2). Enrichment analysis revealed a differential activation in relevant pathways such as ErbB, semaphorin−plexin, and PPAR pathways. From the RNA−seq data, we chose some candidate factors to modulate specific regeneration. NT−3 increased neurites of proprioceptors, whereas NGF and BDNF promoted neurite outgrowth of nociceptors. Lastly, using siRNAs we knocked down the expression of Med12, specifically upregulated in axotomized proprioceptors. Its blockade increased the neurite length exclusively in that subpopulation, suggesting Med12 as a specific regulator of regeneration. In summary, we found that different neurons regenerate differently and activate distinct regenerative mechanisms. These findings provide valuable insights into the mechanisms that drive the regeneration of specific neuron types and could serve as a basis for future studies focused on developing targeted approaches to promote specific regeneration.