Studying Hepatitis B and Hepatitis Delta viruses quasispecies by Next-generation sequencing: Conservation, variability, and interaction

Abstract

El virus de l’hepatitis B (VHB) afecta uns 296 milions de persones arreu del món, més del 5% coinfectades amb el virus de l’hepatitis delta (VHD), causant l’hepatitis vírica més greu. El VHD presenta un domini d’ARN auto-catalític, la ribozima, i una regió que codifica per l’única proteïna viral, l’antigen delta (HDAg). El VHD és un virus satèl·lit del VHB i inhibeix la seva expressió. El mecanisme d’aquesta inhibició encara no es coneix totalment. L’activació de l’interferó tipus I (IFN-I) i l’activació d’enzims mutagènics (APOBEC/AID o ADAR1) podrien desenvolupar un paper important.

Ambdós virus presenten una elevada variabilitat genètica i circulen com una barreja dinàmica de variants estretament relacionades entre sí, denominades quasiespecies (QS). La seqüenciació massiva (NGS) permet un anàlisi complex de la QS així com l’estudi de la seva evolució i detecció d’haplotips minoritaris. Aquesta tesis té com a objectiu analitzar la variabilitat de la QS del VHD i del VHB mitjançant NGS. Està composada de dos estudis principals:

• Estudi de la conservació i evolució de la QS de pacients amb hepatitis crònica delta (CHD) a la ribozima i la comparació amb la regió 5’HDAG.

• Inspeccionar l’impacte del VHD en la variabilitat del VHB i el paper del IFN-I en un model de ratolí VHB-transgènic superinfectat, amb el receptor del IFNalfa/beta inactivat (IFNAR-KO).

En el primer estudi es van recollir mostres longitudinals de sèrum de 25 pacients amb CHD i es va analitzar la QS mitjançant NGS (Miseq, Illumina) per a determinar la conservació de la ribozima i la seva evolució i comparar-la amb el 5’-HDAG. Es van analitzar in vitro les mutacions més rellevants observades en la ribozima. La QS de la ribozima estava globalment conservada, amb una regió hiperconservada (nt715-745). No es van observar diferències en la QS al llarg del temps. Es van detectar tretze mutacions, tres amb major freqüència: T23C, T69C i la deleció C64. Aquesta última va reduir 1log la replicació del VHD in vitro. En comparació amb el d’HDAG, aquest últim era el més complex i variable. La QS viral va evolucionar de forma diferent depenent de la regió analitzada.

En el segon estudi, els ratolins HBVtg wildtype (WT) o IFNAR-KO van ser injectats amb vectors adenoassociats (AAV) amb VHD (superinfecció) o luciferasa (monoinfecció). L’expressió del VHB es va analitzar quantificant l’ADN i l’ARN circulants així com l’ARN intrahepàtic (ARNpg). La QS del ARNpg es va analitzar mitjançant NGS als 7-21 dies post-infecció (dpi) en les regions X i SRT del VHB i el 5’HDAG del VHD. El VHD va determinar una inhibició de l’ADN i l’ARN circulants del VHB, però limitada en el ARNpg. La QS del SRT va ser més complexa als 7dpi que als 21 dpi, a diferència del HBX. Es van identificar múltiples SNVs en ambdós temps, especialment transicions C->T (típiques de APOBEC/AID) en totes les condicions experimentals. Entre les variacions no comunes, algunes afectaven principalment als ratolins superinfectats i no semblaven estar associats amb l’activitat d’enzims mutagènics. La QS del VHD va ser més complexa en els ratolins WT que els KO, especialment als 21dpi, amb major freqüència de transicions G->A típiques de ADAR1.

En l’estudi centrat en el VHD vam identificar una regió hiperconservada de la ribozima com a possible diana de teràpia gènica, i vam observar que la QS del 5’-HDAG evolucionava més ràpid que la ribozima. En el segon estudi, vam veure que els enzims mutagènics podien contribuir a la variabilitat del VHB i el VHD. Cal destacar que algunes mutacions, especialment en ratolins superinfectats, podrien produir-se de forma independent del IFN-I, suggerint que podrien estar implicades altres vies o inclús l’ARN polimerasa circular.

El virus de la hepatitis B (VHB) afecta a unos 296 millones de personas, más del 5% coinfectadas con el virus de la hepatitis delta (VHD), causando la hepatitis vírica más grave. El VHD presenta un dominio de RNA auto-catalítico, la ribozima, y una región que codifica para la única proteína viral, denominada antígeno delta (HDAg). El VHD es un virus satélite del VHB e inhibe fuertemente la expresión de su “helper”. No se conoce completamente el mecanismo de esta inhibición. La activación del interferón tipo I (IFN-I) y la activación de enzimas mutagénicas (APOBEC/AID o ADAR1) podrían ser relevantes.

Ambos virus presentan alta variabilidad genética y circulan como una mezcla dinámica de variantes estrechamente relacionadas, denominadas quasiespecies (QS). La secuenciación masiva (NGS) permite un análisis complejo de la QS, además del estudio de su evolución y detección de haplotipos minoritarios. Esta tesis busca analizar la variabilidad de la QS del VHD y del VHB mediante NGS. Compuesta por dos estudios principales:

• Estudio de la conservación y evolución de la QS de pacientes con hepatitis crónica delta (CHD) en la ribozima y su comparación con la región 5’HDAG.

• Inspeccionar el impacto del VHD en la variabilidad del VHB y el papel del IFN-I en un modelo de ratón VHB-transgénico superinfectado, con el receptor del IFNalfa/beta noqueado (IFNAR-KO).

En el primer estudio, se recogieron dos muestras longitudinales de suero de 25 pacientes con CHD y se analizó la QS mediante NGS (Miseq, Illumina) para determinar la conservación de la ribozima, su evolución y comparar esta última con el 5’-HDAG. Se analizaron in vitro las mutaciones más relevantes observadas en la ribozima. La QS de la ribozima estaba globalmente conservada, con una región híperconservada (nt715-745). No se observaron diferencias en el QS con el tiempo. Se detectaron trece mutaciones, tres con mayor frecuencia (T23C, T69C y deleción C64). La deleción C64 redujo 1log la replicación del VHD in vitro. En comparación con el 5’HDAG, éste era más complejo y variable. En términos de evolución, la QS viral evolucionó de forma diferente según la región analizada.

En el segundo estudio, los ratones HBVtg wild-type (WT) o IFNAR KO fueron inyectados con vectores adenoasociados (AAV) con VHD (superinfección) o luciferasa (monoinfección). La expresión del VHB se analizó cuantificando el ADN y el ARN circulantes y el ARN intrahepático (ARNpg). La QS del ARN viral intrahepático se analizó mediante NGS a los 7 y 21 días post-infección (dpi) en las regiones X y SRT del VHB y el 5’HDAG del VHD. El VHD determinó una inhibición en el ADN y el ARN circulantes del VHB, pero limitada en el ARNpg. La QS del SRT fue más compleja a los 7dpi que a los 21dpi, a diferencia del HBX. Se identificaron múltiples SNVs en ambos tiempos, especialmente C->T transiciones (típicas de APOBEC/AID) en todas las condiciones experimentales. Entre las variaciones no comunes, algunas afectaban principalmente a los ratones superinfectados y no parecían estar asociadas con la actividad de enzimas mutagénicas. La QS del VHD fue más compleja en los ratones WT que en los KO, especialmente a los 21dpi, con mayor frecuencia de transiciones G->A típicas de ADAR1.

En el estudio centrado en el VHD identificamos una región híperconservada de la ribozima como posible diana de terapia génica, y observamos que la QS del 5’-HDAG evolucionaba más rápido que la ribozima. En el segundo estudio, vimos que las enzimas mutagénicas podían contribuir a la variabilidad del VHB y el VHD. Destacamos que algunas mutaciones, especialmente en ratones superinfectados, podrían producirse independientemente del IFN-I, sugiriendo que podrían estar implicadas otras vías o incluso la ARN polimerasa celular.

The Hepatitis B virus (HBV) affects around 296 million people worldwide. Of them, more than 5% are coinfected with Hepatitis delta virus (HDV), causing the most severe viral hepatitis. HDV is a viroid-like virus since it presents a catalytically active RNA portion known as ribozyme, and a region encoding for the unique viral protein, called delta antigen (HDAg). HDV is a satellite virus of HBV and strongly inhibits the expression of its helper. The mechanism behind this inhibition isn’t fully known yet, but the activation of type I interferon (IFN) and its stimulated genes such as mutagenic enzymes (APOBEC/AID or ADAR1) might play a role.

Of note, both viruses are characterized by a high degree of genetic variability and circulate as a dynamic mix of closely related variants called quasispecies (QS). The next-generation sequencing (NGS) allows for a deep analysis of the complete viral QS, supporting the study of the QS evolution and the detection of newly generated and infrequent haplotypes. This thesis aims to analyze HDV and HBV QS variability through NGS and it is composed of two studies focused on:

• Studying QS conservation and evolution from chronic hepatitis delta (CHD) patients in the ribozyme and comparing it with the 5’HDAG region.

• Inspecting the impact of HDV in HBV variability and the role of type I IFN in an HDV-superinfected HBV-transgenic mouse model with the IFNalpha/beta receptor knock-out (KO).

In the first study, two longitudinal serum samples were collected from 25 CHD patients. The QS was analyzed by NGS (Miseq, Illumina) to determine ribozyme QS conservation and its evolution and compare this last with the 5’-HDAG. The most relevant mutations observed in the ribozyme were also tested in vitro. The ribozyme QS was overall conserved, with a hyperconserved region (nt 715-745). No differences in QS were observed over time. Thirteen mutations were detected, three with higher frequency (T23C, T69C and C64 deletion). Of them, C64 deletion reduced 1log the HDV replication in vitro. Compared to the 5’HDAG, the latter one was more complex and variable. In terms of evolution, the viral QS evolved differently depending on the region analyzed.

In the second study, wildtype (WT) or KO for the IFNalpha/beta receptor HBVtg mice were injected with adeno-associated vectors (AAV) containing HDV (superinfection) or luciferase (monoinfection). HBV expression was analyzed by quantifying the circulating HBV DNA and RNA and the intrahepatic RNA (pgRNA). The QS of the intrahepatic viral RNA was analyzed by NGS at 7- and 21-days post-infection (dpi) in the X and SRT regions for HBV and the HDV 5’HDAG. In this model, HDV determined an inhibition in circulating HBV DNA and RNA, and limitedly impact pgRNA. The SRT QS was more complex at 7dpi than at 21dpi, different from the HBX. Multiple SNVs were observed at both times, especially C->T transitions (typical of APOBEC/AID deaminases) in all the experimental conditions. Among the non-common variations, some of them mainly affected superinfected mice and seemed not associated with the activity of specific mutagenic enzymes. HDV QS was more complex in WT than KO mice, especially at 21dpi, with a higher frequency of G->A transitions typical of ADAR1.

In the study focused on HDV, we identified a hyperconserved region of the ribozyme as a possible target for gene therapy, and we observed that 5’-HDAG QS evolved more rapidly than the ribozyme. The second study showed, we saw that the mutagenic enzymes could contribute to the HBV and HDV variability. Of note, some mutations, especially in superinfected mice could occur in a type I IFN-independent way, thus suggesting that other pathways or even the cellular RNA polymerase might be involved.