New strategies for improving the biotechnological production of taxanes

Abstract

[eng] Plant specialized metabolism is the source of a wide range of bioactive compounds, some of which with relevant pharmacological properties. Nowadays, cancer is one of the main causes of mortality worldwide, therefore, the need to produce new compounds against cancer, in a biosustainable way, has become a challenge for plant biotechnology. In this scenario, our target is the biotechnological production of paclitaxel, a potent antineoplastic agent, in Taxus spp. cell biofactories. The goal of this PhD thesis is to build a scaffold of knowledge to deepen into the regulation, at the molecular and cellular level, of taxane biosynthesis, and thus contribute to a better understanding of the regulation of this metabolic pathway, especially those steps still unknown and those bottleneck enzymatic reactions that limit the production of paclitaxel. Board by board in the construction of this scaffold, our results have shown: (1) the synergistic effect of the combined elicitation strategy with coronatine and randomly methylated β-cyclodextrins significantly increases paclitaxel production up to 18-fold compared to control conditions; (2) we have also confirmed that cellular organelles known as lipid droplets are involved in the accumulation, storage, and trafficking of paclitaxel and related taxanes inside and outside Taxus cells; (3) we have corroborated that the putative TB506 hydroxylase is involved in the hydroxylation step at the C2' position of the taxane side chain, as demonstrated by in silico studies and biotransformation assays in protoplasts; (4) through metabolomic studies we have demonstrated the tight relationship that exists between taxane metabolism and other plant primary and specialized metabolic pathways under elicitation conditions; (5) in a circular economy environment, we have verified that taxane extraction residues are not waste, but a source of powerful antioxidants; (6) and finally, after addressing the challenge of the genetic transformation of Taxus spp., we have been able to confirm that metabolic engineering is a powerful tool for designing new Taxus cell lines optimized for paclitaxel production, which, combined with elicitation techniques, act synergistically to achieve production yields of this target compound of up to 300 mg/L in the new transgenic lines obtained.

[spa] A partir del metabolismo especializado de las plantas se puede obtener una amplia gama de compuestos bioactivos, algunos de los cuales poseen relevantes propiedades farmacológicas. El cáncer, hoy en día, es una de las principales causas de mortalidad a nivel mundial, por ello, la necesidad de producir nuevos compuestos contra el cáncer, de una manera biosostenible, se ha convertido en un reto para la biotecnonología vegetal. En este escenario, nuestra diana es la producción biotecnológica de paclitaxel, un potente agente antineoplásico, en biofactorías celulares de Taxus spp. El objetivo de esta Tesis Doctoral es contribuir a la construcción de un andamio de conocimiento para profundizar en la regulación, a nivel molecular y celular, de la biosíntesis de taxanos, y de esta forma contribuir a un mejor entendimiento de la regulación de esta ruta metabólica, especialmente de aquellos pasos aún desconocidos y aquellas reacciones enzimáticas que limitan la producción de paclitaxel al actuar como limitantes del flujo metabólico. Piso a piso, en la construcción de este andamio, nuestros resultados han demostrado: (1) el efecto sinérgico de la estrategia de elicitación combinada con coronatina y β-ciclodextrinas metiladas aleatoriamente aumenta significativamente la producción de paclitaxel hasta 18 veces en comparación con las condiciones control; (2) también hemos confirmado que los orgánulos celulares conocidos como vesículas lipídicas participan en la acumulación, almacenamiento y tráfico de paclitaxel y taxanos afines dentro y fuera de las células; (3) hemos corroborado que la potencial hidroxilasa TB506 está implicada en el paso de hidroxilación en la posición C2' de la cadena lateral de los taxanos, como demuestran los estudios in silico y los ensayos realizados de biotransformación en protoplastos; (4) mediante estudios metabolómicos hemos demostrado la estrecha relación que existe entre el metabolismo de taxanos y otras vías metabólicas primarias y secundarias vegetales, bajo condiciones de elicitación; (5) en el entorno de la economía circular, hemos comprobado que los residuos de la extracción de taxanos no son deshechos, sino que una fuente de potentes antioxidantes; (6) y finalmente, tras abordar el reto de la transformación genética de Taxus, hemos podido confirmar que la ingeniería metabólica es una potente herramienta para diseñar nuevas líneas celulares de Taxus optimizadas para la producción de paclitaxel, que combinada con las técnicas de elicitación actúan de forma sinérgica llegando a alcanzar producciones de este compuesto diana de hasta 300 mg/L en las nuevas líneas transgénicas obtenidas.