Regulation of Dopamine Synthesis and Accumulation in Rat Brain through G protein-independent Mechanisms

Abstract

La capacitat dels receptors acoblats a proteïnes G, com els receptors D2 (D2R), per a heterodimeritzar i generar nous complexos de senyalització ha demostrat el seu enorme potencial per a accedir a diverses cascades de senyalització i modular la naturalesa del senyal transduït. La senyalització del receptor D2 es reconeix com més complexa que simples canvis en els nivells de cAMP, i els agonistes esbiaixats que poden modular exclusivament la via de la ß-arrestina dels receptors D2 són una eina farmacològica prometedora. GSK3ß, una quinasa senyalitzadora de la ß-arrestina, s'ha implicat en una pluralitat de patologies, trastorns mentals i malalties neurodegeneratives incloses. Malgrat això, les eines disponibles per examinar la senyalització D2R-arrestina-GSK3 són limitades. En la presentat tesi es va provar la fiabilitat de diversos anticossos comercials contra els receptors D2 i la ß-arrestina i es va trobar que eren inespecífics i no aptes per al seu ús amb garanties. Utilitzant HPLC i miniprismes d'estriat de cervell de rata fresc ex vivo, també demostro que l'agonista del receptor D2 esbiaixat per a ß-arrestina UNC9994 redueix dràsticament l'acumulació de dopamina. També es va trobar que l'inhibidor de GSKß CHIR99021 disminueix l'acumulació i síntesi de dopamina en inhibir de forma indirecta la tirosina hidroxilasa (TH), l'enzim limitant de la ruta de síntesi de dopamina en el cervell. Vaig usar altres dos inhibidors de GSK&ß, SB216763 i liti, que van resultar ser molt menys efectius en la modulació de la dinàmica de la dopamina a causa de l'absència d'acció de GSK3ß en TH, la qual cosa suggereix un mecanisme d'acció alternatiu de CHIR99021 que no sigui únicament la inhibició de GSK3. CHIR99021 també afecta l'emmagatzematge de dopamina de manera similar a la tetrabenazina, un inhibidor de VMAT2 utilitzat en la malaltia de Huntington. L'anàlisi d'espectrometria de masses d'una mostra de TH immunoprecipitada va revelar un lloc de fosforilació nou, la treonina 30. I finalment, encara que en gran manera es considera que és un enzim citosòlic, vaig observar una major activitat de TH en els mitocondris en comparació amb el citosol. Aquests resultats mostren una contribucio de l'agonisme esbiaixat de la ß-arrestina en el metabolisme de la dopamina, i que CHIR99021 pot conduir a una disminució de la dopamina en el cos estriat del cervell a través de una inactivació de la TH relacionada amb l'emmagatzemament vesicular, la qual cosa obre la possibilitat del seu ús en trastorns relacionats amb la dopamina i mostra efectes "off-target" a considerar en futurs assajos clínics.

La capacidad de los receptores acoplados a proteínas G, como los D2 (D2R), para heterodimerizarse y generar nuevos complejos de señalización ha demostrado su gran potencial para acceder a diversas cascadas de señalización y modular la señal transducida. La señalización del D2R se reconoce como más compleja que simples cambios en los niveles de cAMP, y los agonistas sesgados que pueden modular exclusivamente la vía de la ß-arrestina de los D2R son una herramienta farmacológica prometedora. GSK3ß, una quinasa señalizadora de la ß-arrestina, se ha implicado en una pluralidad de patologías, trastornos mentales y enfermedades neurodegenerativas incluidas. Sin embargo, las herramientas disponibles para examinar la señalización D2R-arrestina-GSK3 son limitadas. En la presente tesis se probó la fiabilidad de varios anticuerpos contra los D2R y la ß-arrestina y se encontró que eran inespecíficos y no aptos para su uso con garantías. Utilizando HPLC y miniprismas de estriado de cerebro de rata fresco ex vivo, también observé que el agonista del D2R sesgado para ß-arrestina UNC9994 reduce drásticamente la acumulación de dopamina. También se encontró que el inhibidor de GSKß CHIR99021 disminuye la acumulación y síntesis de dopamina al inhibir indirectamente la tirosina hidroxilasa (TH). Usé otros dos inhibidores de GSKß, SB216763 y litio, que resultaron ser mucho menos efectivos en la modulación de la dinámica de la dopamina debido a la ausencia de acción de GSK3ß en TH, lo que sugiere un mecanismo de acción alternativo de CHIR99021 que no sea únicamente la inhibición de GSK3. CHIR99021 también afectó el almacenamiento de dopamina de manera similar a la tetrabenazina, un inhibidor de VMAT2 usado en la enfermedad de Huntington. El análisis por espectrometría de masas de una muestra de TH inmunoprecipitada reveló un sitio de fosforilación nuevo, la treonina 30. Y finalmente, aunque en gran medida se considera como una enzima citosólica, observé una mayor actividad de TH en las mitocondrias en comparación con el citosol. Estos resultados muestran una contribución del agonismo sesgado de la ß-arrestina en el metabolismo de la dopamina, y que CHIR99021 puede conducir a una disminución de la dopamina en el cuerpo estriado del cerebro a través de una inactivación de la TH relacionada con el almacenamiento vesicular, lo que abre la posibilidad de su uso en trastornos relacionados con la dopamina y muestra efectos "off-target" a considerar en futuros ensayos clínicos.

The ability of G protein coupled receptors such as D2 receptors to heterodimerize and generate novel signaling complexes has demonstrated the tremendous potential of these receptors to access diverse signaling cascades, and to modulate the nature of the transduced signal. D2 receptor signaling has become widely appreciated to be more complex than simply changes in cAMP levels, and biased agonists that are able to exclusively modulate the ß-arrestin pathway of D2 receptors present a promising pharmacological tool. GSK3ß, a downstream target of ß-arrestin, has been implicated in a plurality of pathologies, including mental disorders and neurodegenerative diseases. However, the tools available to assess D2-arrestin-GSK3 signaling are limited. In this study, the reliability of several commercial antibodies against D2 receptors and ß-arrestin were tested and found to be partly unspecific. Using HPLC and fresh rat brain striatal minces ex vivo, I also showed that the ß-arrestin biased D2 receptor agonist UNC9994 dramatically decreases dopamine accumulation. It was also found that the GSKß; inhibitor CHIR99021 decreases dopamine accumulation and synthesis by indirectly inhibiting Tyrosine hydroxylase (TH), the rate limiting enzyme in brain dopamine biosynthesis. I used two other GSKß; inhibitors, SB216763 and lithium, which were found to be much less effective in modulating dopamine dynamics due to absence of GSK3ß action on TH, suggesting an alternative mechanism of action of CHIR99021 other than solely GSK3 inhibition. CHIR99021 also affected dopamine storage in a similar manner to Tetrabenazine, a VMAT2 inhibitor prescribed for Huntington's disease. Mass spectrometry analysis of an immunoprecipitated TH sample revealed a novel phosphorylation site, Threonine 30. And finally, although largely considered to be a cytosolic enzyme, I observed higher TH activity in the mitochondria as compared to the cytosol. These results show a contribution of ß-arrestin biased agonism to dopamine metabolism, and that CHIR99021 can lead to dopamine decrease in brain striatum through vesicle storage-related TH inactivation, opening the possibility of its use in dopamine-related disorders, and shows off-target effects to be considered in future clinical trials.