Safety and therapeutical efficacy of the anti-ageing protein klotho for treating age-associated deficits and increasing longevity

Abstract

Els avenços en l'atenció sanitària i la qualitat de vida a les societats modernes han provocat un augment del percentatge de població que arriba a edats avançades, i es preveu que al 2060 el 25% dels ciutadans dels països occidentals tingui més de 65 anys. L'envelliment és un dels factors de risc principals d'una àmplia gamma de patologies, com l'osteoporosi, la sarcopènia i la degeneració cognitiva. Aquestes afeccions van acompanyades de patiment, discapacitat i elevats costos econòmics i socials, per la qual cosa calen noves teràpies per aconseguir un envelliment saludable. La proteïna klotho (KL) ha estat identificada com una prometedora molècula antienvelliment a causa de les seves accions pleiotròpiques, amb efectes prolongevitat en vies com la senyalització de la insulina/factor de creixement similar a la insulina i Wnt, així com la modulació de l'estrès inflamatori i oxidatiu. Aquí, explorem la seguretat i el potencial antienvelliment de la isoforma secretada de KL als ratolins SAMP8 i C57BL/6J, models murins d'envelliment accelerat i no patològic, respectivament. En primer lloc, es van expressar diferents isoformes de KL en animals joves sans per estudiar els possibles efectes negatius del tractament. Cal destacar que la isoforma p-KL, forma soluble de la isoforma de KL de longitud completa (m-KL), va alterar la regulació del metabolisme mineral, generant un fort fenotip osteoporòtic. Per contra, la isoforma s-KL no va interferir en el metabolisme mineral ni va induir altres efectes adversos en els diferents estudis histològics i serològics realitzats, cosa que suggereix seguretat farmacològica. A continuació, es van administrar vectors AAV9 portadors d'una còpia de l'ADNc de s-KL a ratolins SAMP8 i C57BL/6J envellits, cosa que va incrementar eficientment la concentració de proteïna s-KL en sèrum, millorant el fenotip d'envelliment als diferents òrgans analitzats . El tractament amb KL va millorar l'aptitud en proves de comportament, cosa que es va correlacionar amb una reducció de la fibrosi muscular i un augment de la regeneració muscular. Els paràmetres microestructurals corticals i trabeculars als ossos envellits, mesurats mitjançant anàlisi de MicroCT, també van millorar en els animals tractats. A més, les capacitats cognitives dels animals envellits van millorar, fet que va venir acompanyat d'un augment dels marcadors de neurogènesi adulta (DCX), i la normalització dels marcadors cel·lulars a l'hipocamp com les poblacions de cèl·lules Iba1+ i GFAP+, recolzat per l'anàlisi histològica i transcripcional. Sorprenentment, l'expressió a llarg termini de s-KL degut al tractament amb AAV va conduir a un augment del 20% en la longevitat total dels ratolins C57BL/6J. Aquests resultats mostren per primera vegada el potencial de l'augment exogen de la proteïna s-KL per tractar diversos dèficits associats a l'edat, augmentant tant la salut com la longevitat dels animals no alterats genèticament. Després d'aquests resultats prometedors, es va avaluar la possibilitat de traslladar les propietats beneficioses de s-KL a models animals més propers a l'humà. Per això, es va administrar a individus envellits de l'espècie de primat no humà Microcebus murinus un AAV9 que expressava ADNc de s-KL humà. Nou mesos després del tractament, els animals tractats amb s-KL van millorar el rendiment en una prova cognitiva, cosa que suggereix l'eficàcia de s-KL en aquest complex model animal. Per tant, com que s-KL té un perfil farmacològic segur i és una proteïna secretable, les estratègies que augmenten els nivells de s-KL representen un enfocament prometedor per reduir en humans l'impacte de la degeneració associada a l'edat en múltiples òrgans.

Los avances en la atención sanitaria y la calidad de vida en las sociedades modernas han provocado un aumento del porcentaje de población que alcanza edades avanzadas, y se prevé que en 2060 el 25% de los ciudadanos de los países occidentales tenga más de 65 años. El envejecimiento es uno de los principales factores de riesgo de una amplia gama de patologías, como la osteoporosis, la sarcopenia y la degeneración cognitiva. Estas afecciones van acompañadas de sufrimiento, discapacidad y elevados costes económicos y sociales, por lo que se necesitan nuevas terapias para lograr un envejecimiento saludable. La proteína klotho (KL) ha sido identificada como una prometedora molécula antienvejecimiento debido a sus acciones pleiotrópicas, con efectos pro-longevidad en vías como la señalización de la insulina/factor de crecimiento similar a la insulina y Wnt, así como la modulación del estrés inflamatorio y oxidativo. Aquí, exploramos la seguridad y el potencial antienvejecimiento de la isoforma secretada de KL en los ratones SAMP8 y C57BL/6J, modelos murinos de envejecimiento acelerado y no patológico, respectivamente. En primer lugar, se expresaron diferentes isoformas de KL en animales jóvenes sanos para estudiar los posibles efectos negativos del tratamiento. Cabe destacar que la isoforma p-KL, forma soluble de la isoforma de KL de longitud completa (m-KL), alteró la regulación del metabolismo mineral, generando un fuerte fenotipo osteoporótico. Por el contrario, la isoforma s-KL no interfirió en el metabolismo mineral ni indujo otros efectos adversos en los diferentes estudios histológicos y serológicos realizados, lo que sugiere seguridad farmacológica. A continuación, se administraron vectores AAV9 portadores de una copia del ADNc de s-KL a ratones SAMP8 y C57BL/6J envejecidos, lo que incrementó eficientemente la concentración de proteína s-KL en suero, mejorando el fenotipo de envejecimiento en los diferentes órganos analizados. El tratamiento con KL mejoró la aptitud en pruebas de comportamiento, lo que se correlacionó con una reducción de la fibrosis muscular y un aumento de la regeneración muscular. Los parámetros microestructurales corticales y trabeculares en los huesos envejecidos, medidos mediante análisis de MicroCT, también mejoraron en los animales tratados. Además, las capacidades cognitivas de los animales envejecidos mejoraron, lo que vino acompañado de un aumento de los marcadores de neurogénesis adulta (DCX), y la normalización de los marcadores celulares en el hipocampo como las poblaciones de células Iba1+ y GFAP+, apoyado por el análisis histológico y transcripcional. Sorprendentemente, la expresión a largo plazo de s-KL mediada por AAV condujo a un aumento del 20 % en la longevidad total de los ratones C57BL/6J. Estos resultados muestran por primera vez el potencial del aumento exógeno de la proteína s-KL para tratar varios déficits asociados a la edad, aumentando tanto la salud como la longevidad de los animales no alterados genéticamente. Tras estos prometedores resultados, se evaluó la posibilidad de trasladar las propiedades beneficiosas de s-KL a modelos animales más cercanos al humano. Para ello, se administró a individuos envejecidos de la especie de primate no humano Microcebus murinus un AAV9 que expresaba ADNc de s-KL humano. Nueve meses después del tratamiento, los animales tratados con s-KL mejoraron su rendimiento en una prueba cognitiva, lo que sugiere la eficacia de s-KL en este complejo modelo animal. En general, dado que s-KL tiene un perfil farmacológico seguro y es una proteína secretable, las terapias génicas que aumentan los niveles de s-KL representan un enfoque prometedor para reducir en humanos el impacto de la degeneración asociada a la edad en múltiples órganos.

Advances in health care and quality of life in modern societies have led to an increase in the percentage of the population reaching advanced ages, with a projected 25 % of western countries citizens being over the age of 65 by 2060. Aging is one of the main risk factors for a wide range of pathologies, including osteoporosis, sarcopenia, and cognitive degeneration. These conditions are accompanied by suffering, disability, and elevated economic and social costs, thus new therapies are needed to achieve healthy aging. The protein klotho (KL) has been identified as a promising anti-aging molecule due to its pleiotropic actions, with pro-longevity effects on pathways such as insulin/insulin-like growth factor and Wnt signaling, as well as inflammatory and oxidative stress modulation. Here, we explored the safety and anti-aging potential of the secreted isoform of KL in the SAMP8 and C57BL/6J mice, murine models for accelerated and non-pathological aging, respectively. First, different KL isoforms were expressed in young healthy animals in order to study possible negative effects of the treatment. of note, the p-KL isoform, solubilized form of the full-length KL protein (m-KL), altered mineral metabolism regulation, generating a strong osteoporotic phenotype. In contrast, the s-KL isoform did not interfere into mineral metabolism or induced other adverse effects in the different histological and serological studies performed, suggesting pharmacological safety. Next, AAV9 vectors carrying a copy of the s-KL cDNA were delivered into aged SAMP8 and C57BL/6J mice, which efficiently increased concentration of s-KL protein in serum, improving the aging phenotype in different organs analyzed. The KL treatment improved fitness in behavioral tests, which correlated with reduced muscular fibrosis and increased muscle regeneration. Cortical and trabecular microstructural parameters in the aged bones, measured by MicroCT analysis, were also improved in treated animals. In addition, cognitive capacities of aged animals were improved, which was accompanied by increased markers of adult neurogenesis (DCX), and normalization of cellular markers in the hippocampus like Iba1+ and GFAP+ cells populations, supported by histological and transcriptional analysis. Remarkably, long-term AAV-mediated expression of s-KL lead to a 20 % increase in total longevity of C57BL/6J mice. These results show for the first time, the potential of exogenous increase in s-KL protein to treat several age-associated deficits, increasing both health and lifespan of wild type animals. Following these promising results, the translatability of s-KL beneficial properties to animal models closer to human was assessed. For this, aged individuals of the non-human primate species Microcebus murinus were administered with AAV9 expressing human s-KL cDNA. Nine months after the treatment, s-KL-treated animals improved performance in a cognitive test, suggesting s-KL effectivity in this complex animal model. Overall, since s-KL has a safe pharmacological profile and is a naturally secreted protein, gene therapies increasing s-KL levels represent a promising approach to reduce in humans the impact of the age-associated degeneration in multiple organs.