Exploring the dechlorination metabolism of chloromethanes in anaerobic bacteria

Abstract

Els compostos de metà clorats sovint contaminen el medi ambient, incloent-hi les aigües subterrànies, la qual cosa suposa un risc per al medi ambient i per a la població humana. L'escassetat creixent d'aigua dolça ha generat un interès especial en la remediació dels aqüífers, entre els quals, la bioremediació és una alternativa efectiva i econòmicament viable que utilitza microorganismes per degradar compostos halogenats o transformar-los en productes menys tòxics, mitjançant bacteris o enzims microbians. Aquesta tesi busca aprofundir en el coneixement dels bacteris anaerobis capaços de transformar clorometans en compostos no tòxics a través de dos bacteris amb metabolismes diferents. El primera bacteri, Dehalobacter sp., és un bacteri respirador d'organohalogenats (OHRB) que utilitza el triclorometà com a acceptor final d'electrons i el transforma en diclorometà. El segon bacteri, Dehalobacterium sp., fermenta el diclorometà generant formiat i acetat com a productes finals innocus. Vam enriquir un cultiu bacterià derivat d'un pou contaminat que transformava TCM a DCM. Vam obtenir un consorci estable que conté una nova soca de Dehalobacter sp., que vam anomenar soca 8M. Aquest cultiu es va caracteritzar i, a més de TCM, la PCR quantitativa va demostrar que Dehalobacter sp. soca 8M també pot créixer en 1,1,2-tricloroetà (1,1,2-TCA) com a font d'energia. Es van realitzar anàlisis isotòpics de carboni i clor d'aquest bacteri durant la degradació de TCM en tres sistemes enzimàtics i va permetre el càlcul d'un fraccionament isotòpic dual únic i consistent de C-Cl per a tots els tres sistemes ΛC/Cl combinat = 2,8 ± 0,3), que difereix significativament d'altres bacteris anaerobis o mecanismes de transformació de TCM estudiats fins ara. A partir d'aquí, es va seqüenciar el genoma de la soca 8M i es va aplicar una combinació d'estudis de proteòmica, assajos d'activitat enzimàtica, electroforesi de gels natius i espectrometria de masses de proteïnes per estudiar la RdhA i altres proteïnes implicades en la cadena respiratòria d'aquesta soca. La RdhA 40029 va resultar ser la proteïna més abundant durant la degradació tant de TCM com de 1,1,2-TCA, i la distribució de proteïnes al llarg del carril del gel d'electroforesi nativa va suggerir per primera vegada almenys tres interaccions proteïna-proteïna entre les proteïnes de la cadena respiratòria de Dehalobacter. El bacteri fermentador de DCM Dehalobacterium formicoaceticum soca EZ94 forma part d'un cultiu mixt estable que conté també Desulfovibrio, Acetobacterium i Wolinella, i en aquesta tesi es van estudiar les interaccions sinèrgiques entre ells durant la transformació anaeròbia del DCM utilitzant DCM marcat amb 13C, tècniques de dilució per extinció i seqüenciació del gen 16S rRNA. Aquests estudis fisiològics van revelar que el DCM es degradava en el cultiu mixt en un procés d'almenys tres passos: i) fermentació del DCM a acetat i format, ii) oxidació del format a CO2 i H2, i iii) acetogènesi reductiva de H2/CO2. La disponibilitat del genoma seqüenciat de la soca EZ94 ens va permetre investigar més a fons les proteïnes implicades en la decloració del DCM, que encara són desconegudes. Els assaigs d'activitat amb cianocobalamina i diferents fraccions proteiques van suggerir que la proteïna decloradora de DCM era una proteïna soluble cobalamina dependent. El gel de electroforesi nativa combinat amb assajos d'activitat enzimàtica i espectrometria de masses de proteïnes van indicar que la metiltransferasa MecC es detectava en major abundància on s'observava una major transformació de DCM. Basant-nos en aquests resultats bioquímics i en l'anàlisi estructural de les proteïnes designades del casset genòmic Mec (de les sigles en anglès "methylene chloride catabolism", proposem que MecC forma un heterodímer amb MecB (una metiltransferasa cobalamina dependent) i junts formen la unitat catalítica inicial implicada en la decloració del DCM.

Los compuestos de metano clorados a menudo contaminan el medio ambiente, incluyendo las aguas subterráneas, lo que representa un riesgo para el medio ambiente y para la población humana. La creciente escasez de agua dulce ha generado un interés particular en la remedición de acuíferos. Entre las técnicas de remedición, la biorremediación es una alternativa efectiva y económicamente viable que utiliza microorganismos para degradar compuestos halogenados o transformarlos en productos menos tóxicos, utilizando bacterias o enzimas microbianas. Esta tesis busca profundizar en el conocimiento de las bacterias anaerobias capaces de transformar los clorometanos en compuestos no tóxicos a través de dos bacterias metabólicamente diferentes. La primera bacteria, Dehalobacter sp., es una bacteria respiradora de organohalogenados (OHRB) que utiliza el triclorometano (TCM) como aceptor final de electrones y lo transforma en diclorometano (DCM). La segunda bacteria, Dehalobacterium sp., fermenta el DCM, generando formiato y acetato como productos finales inocuos. En nuestro grupo de investigación previamente se obtuvo un cultivo bacteriano a partir de un pozo contaminado que transformaba TCM en DCM. Enriquecimos este cultivo y obtuvimos un consorcio estable que contenía una nueva cepa de Dehalobacter sp., a la que denominamos cepa 8M que además del TCM, la PCR cuantitativa demostró que Dehalobacter sp. cepa 8M también puede crecer con 1,1,2-tricloroetano (1,1,2-TCA) como fuente de energía. Análisis isotópicos de carbono y cloro de esta bacteria durante la degradación del TCM en tres sistemas enzimáticos permitió el cálculo de un fraccionamiento isotópico dual único y consistente de C-Cl para los tres sistemas (ΛC/Cl combinado = 2,8 ± 0,3), que difiere significativamente de otros mecanismos de transformación de TCM estudiados hasta la fecha. A partir de aquí, se secuenció el genoma de la cepa 8M y se aplicó una combinación de estudios de proteómica, ensayos de actividad enzimática, electroforesis de geles nativos y espectrometría de masas de proteínas para estudiar la RdhA y otras proteínas involucradas en la cadena respiratoria de esta cepa. La RdhA 40029 resultó ser la proteína más abundante durante la degradación tanto del TCM como del 1,1,2-TCA, y la distribución de proteínas a lo largo del gel de electroforesis nativos sugirió por primera vez al menos tres interacciones proteína-proteína en la cadena respiratoria de Dehalobacter. Dehalobacterium formicoaceticum cepa EZ94 es parte de un cultivo mixto estable que contiene también Desulfovibrio, Acetobacterium y Wolinella. En esta tesis, se estudiaron las interacciones sinérgicas entre estos microorganismos durante la transformación anaeróbica del DCM mediante el uso de DCM marcado con 13C, técnicas de dilución por extinción y secuenciación del gen 16S rRNA. Estos estudios fisiológicos revelaron que el DCM se degrada en el cultivo mixto en al menos tres etapas: i) fermentación del DCM a acetato y formiato, ii) oxidación de formiato a CO2 e H2, y iii) acetogénesis reductiva de H2/CO2. La reciente secuenciación del genoma de la cepa EZ94 permitió investigar las proteínas involucradas en la decloración del DCM, que aún son desconocidas. Los ensayos de actividad con cianocobalamina y diferentes fracciones de proteínas sugirieron que la proteína decloradora del DCM era una proteína soluble dependiente de la corrinoide. Electroforesis en gel nativo combinada con ensayos de actividad enzimática y espectrometría de masas indicaron que la metiltransferasa MecC está relacionada con la degradación del DCM. A partir de estos hallazgos bioquímicos y el análisis estructural de las proteínas del casete génico implicado en el catabolismo de cloruro de metileno (denominado Mec por sus siglas en inglés de "methylene chloride catabolism", se propone la hipótesis de que MecC forma un heterodímero con MecB (una metiltransferasa cobalamina dependiente) y juntas forman la unidad catalítica inicial declorado

Chlorinated methane compounds often contaminate the environment, including groundwater, which poses a risk to both the environment and the human population. The growing scarcity of fresh water has generated particular interest in the remediation of aquifers. Among the remediation techniques, bioremediation is an effective and economically viable alternative that uses microorganisms to degrade halogenated compounds or transform them into less toxic products in groundwater, using bacteria or microbial enzymes. However, it is still a relatively novel strategy that needs a greater understanding of the physiology, biochemistry, and interactions of the microorganisms involved, which sometimes limits its implementation. This thesis seeks to deepen the knowledge of anaerobic bacteria capable of transforming chloromethanes into non-toxic compounds through two metabolically different bacteria. The first bacterium, Dehalobacter sp., is an organohalide-respiring bacteria (OHRB) that uses trichloromethane (TCM) as final electron acceptor and transforms it into dichloromethane (DCM). The second bacterium, Dehalobacterium sp., ferments DCM, generating formate and acetate as innocuous end products. Previously in our research group, a bacterial culture derived from a well contaminated with a mixture of halogenated compounds transformed TCM to DCM. In this thesis, we enriched this culture and obtained a stable consortium containing a new strain of Dehalobacter sp., which we named strain 8M. In addition to TCM, quantitative PCR demonstrated that Dehalobacter sp. strain 8M can also grow on 1,1,2-trichloroethane (1,1,2-TCA) as an energy source. Carbon and chlorine isotope analyses of this bacterium were performed during TCM degradation in three enzymatic systems. The small but significant isotopic fractionation resulting in the three systems allowed the calculation of a unique and consistent dual isotopic fractionation of C-Cl for all three systems ΛC/Cl combined = 2.8 ± 0.3), which differs significantly from other anaerobic bacteria or TCM transformation mechanisms studied to date. From here, the genome of strain 8M was sequenced and a combination of proteome profiling, enzymatic activity assays, blue native electrophoresis, and protein mass spectrometry was applied to study the RdhA and other proteins involved in the respiratory chain of this strain. RdhA 40029 turned out to be the most abundant protein during the degradation of both TCM and 1,1,2-TCA, and the distribution of proteins along the blue native electrophoresis gel lanes suggested for the first time at least three protein-protein interactions among the proteins described as part of the respiratory chain of Dehalobacter. The DCM-fermenting bacterium Dehalobacterium formicoaceticum strain EZ94 was the following microorganisms studied. Strain EZ94 is part of a stable mixed culture containing Desulfovibrio, Acetobacterium, and Wolinella and, in this thesis, the synergistic interactions among them during the anaerobic transformation of DCM were studied using 13C-labelled DCM, dilution-to-extinction techniques and 16S rRNA gene sequencing. These physiological studies revealed that DCM was degraded in the mixed culture at least in a three-step process: i) fermentation of DCM to acetate and formate, ii) formate oxidation to CO2 and H2, and iii) H2/CO2 reductive acetogenesis. The availability of the sequenced genome of strain EZ94 allowed us to investigate further the proteins involved in DCM dechlorination, which are still unknown. Activity assays with cyanocobalamin and different protein fractions suggested that the DCM dechlorinating protein was a soluble corrinoid-dependent protein. Blue native gel electrophoresis combined with enzymatic activity assays and protein mass spectrometry indicated that the methyltransferase MecC was highly detected in gel slices of blue native electrophoresis gels with the highest DCM transformation. Based on these biochemical findings and the structural analy