Regulación de la expresión de la histona H1: papel del epitranscriptoma (m6A) y de la degradación por el proteasoma

Abstract

La histona H1 s'uneix al DNA a l'entrada/sortida del nucleosoma i promou la compactació de la cromatina. En humans, la família de la H1 té 11 subtipus, 7 dels quals s'expressen en cèl·lules somàtiques. Les proporcions entre aquests subtipus són variables i formen el que es coneix com el complement d'H1, que és propi de cada cèl·lula. La regulació coordinada de l'expressió gènica dels subtipus d'H1 és complexa i està poc estudiada, però el seu coneixement és essencial per a entendre com es pot adaptar i ajustar el complement de la H1 a cada tipus cel·lular i a cada situació concreta. Els principals aspectes que dificulten el seu estudi són, la similitud de seqüència entre alguns subtipus que afecta a l'especificitat dels anticossos o l'absència de poliA als mRNAs. En aquesta tesi s'aborden dues de les etapes menys estudiades de la regulació de la H1, el paper de la metilació de m6A dels mRNAs, i la degradació de la proteïna mitjançant el proteasoma. La marca de m6A té diferents papers en el metabolisme del mRNA (localització, estabilitat, foment de la traducció o de la degradació). La seva presència en els mRNAs de la H1 no ha estat estudiada prèviament, però l'anàlisi de dades públiques la confirma. Una modificació del protocol de MeRIPseq per a incloure els mRNAs sense cua de poliA ens ha permès determinar l'enriquiment en m6A durant el cicle cel·lular de les variants H1.0 i H1.4, tenint també H1.2 uns nivells notables. La funció de m6A ve determinada pel lector que se li uneix, i per això, es van realitzar experiments de RIP acoblats a tècniques de proteòmica per a identificar les proteïnes unides als mRNAs. A més, es va inhibir químicament la metiltransferasa amb cicloleucina per a estudiar els efectes que m6A provoca en les H1. Els resultats obtinguts mostren que m6A fomenta la degradació d'H1.0, promou l'estabilitat d'H1.2 mitjançant IGF2BP1 i PRRC2A i facilita la transcripció, degradació i traducció d'H1.4 a través de hnRNPD i hnRNPM. D'altra banda, s'ha abordat el paper del proteasoma a la degradació d'H1 mitjançant la inhibició amb MG132 i bortezomib. Els resultats mostren que el proteasoma regula els nivells de proteïna de la H1, perquè totes les variants s'acumulen en el citoplasma. El fet de no acumular-se en el nucli ni afectar globalment la cromatina sembla prevenir efectes no desitjats en el nucli. Quant al mecanisme de degradació, s'ha pogut determinar que és independent de ubiqüitina i mediat pel proteasoma 20S lliure que reconeix la H1 a través del domini C-terminal per les seves càrregues i la seva estructura intrínsecament desordenada.

La histona H1 se une al DNA a la entrada/salida del nucleosoma y promueve la compactación de la cromatina. En humanos, la familia de la H1 tiene 11 subtipos, 7 de los cuales se expresan en células somáticas. Las proporciones entre dichos subtipos son variables y forman lo que se conoce como el complemento de H1, que es propio de cada célula. La regulación coordinada de la expresión génica de los subtipos de H1 es compleja y está poco estudiada, pero su conocimiento es esencial para entender cómo se puede adaptar y ajustar el complemento de la H1 a cada tipo celular y a cada situación concreta. Los principales aspectos que dificultan su estudio son, la similitud de secuencia entre algunos subtipos que afecta en la especificidad de los anticuerpos o la ausencia de poliA en sus mRNAs. En esta tesis se abordan dos de las etapas menos estudiadas de la regulación de la H1, el papel de la metilación de m6A de los mRNAs, y la degradación de la proteína mediante el proteasoma. La marca de m6A tiene distintos papeles en el metabolismo del mRNA (localización, estabilidad, fomento de la traducción o de la degradación). Su presencia en los mRNAs de la H1 no ha sido estudiada previamente, pero el análisis de datos público la confirma. Una modificación del protocolo de MeRIPseq para incluir los mRNAs sin cola de poliA nos ha permitido determinar el enriquecimiento en m6A durante el ciclo celular de las variantes H1.0 y H1.4, teniendo también H1.2 unos niveles notables. La función de m6A viene determinada por el lector que se le une y por ello se realizaron experimentos de RIP acoplados a técnicas de proteómica para identificar las proteínas unidas a los mRNAs. Además, se inhibió químicamente la metiltransferasa con cicloleucina para estudiar los efectos que m6A provoca en las H1. Los resultados obtenidos muestran que m6A fomenta la degradación de H1.0, promueve la estabilidad de H1.2 mediante IGF2BP1 y PRRC2A y facilita la transcripción, degradación y traducción de H1.4 a través de hnRNPD y hnRNPM. Por otra parte, se ha abordado el papel del proteasoma a la degradación de H1 mediante la inhibición con MG132 y bortezomib. Los resultados muestran que el proteasoma regula los niveles de proteína de la H1, pues todas las variantes se acumulan en el citoplasma. El hecho de no acumularse en el núcleo ni afectar globalmente a la cromatina parece prevenir efectos no deseados en el núcleo. En cuanto al mecanismo de degradación, se ha podido determinar que es independiente de ubiquitina y mediado por el proteasoma 20S libre que reconoce la H1 a través del dominio C-terminal por sus cargas y su estructura intrínsicamente desordenada.

Histone H1 binds DNA at the entry/exit site of the nucleosome and promotes chromatin compaction. In humans, H1 family has 11 subtypes, 7 of which are expressed in somatic cells. The H1 complement, defined as the proportions of the somatic subtypes is variable and characteristic of each cell type. Coordinated regulation of gene expression of H1 subtypes is complex and not well studied, but its knowledge is essential to understand how the H1 complement can adapt and adjust to each cell type and situation. The main aspects that difficult its study are the similarity between subtype sequences and the absence of a polyA tail in their mRNAs. In this thesis, two of the most unknown H1 regulation levels are studied: post-transcriptional regulation (specifically m6A methylation of mRNAs) and protein degradation by the proteasome. The m6A mark has different roles in mRNA metabolism (location, stability, translation or degradation promotion). Its presence in H1 mRNAs has not been studied previously, but the analysis of public data confirmed its presence. Modifications of MeRIPseq protocol to include mRNAs lacking polyA tail has allowed us to determine the m6A enrichment of H1.0 and H1.4 variants, with H1.2 with intermediate levels during cell cycle. Function of m6A is determined by its reader, therefore RIP experiments coupled to proteomics were performed to identify mRNA binding proteins. In addition, the methyltransferase was chemically inhibited with cycloleucine to study m6A effects in H1. The results show that m6A promotes H1.0 degradation, H1.2 stability through IGF2BP1 and PRRC2A and, for H1.4, it facilitates transcription, degradation, and translation via hnRNPD and hnRNPM. The role of proteasome to H1 degradation was also studied by its inhibition with MG132 and bortezomib. The results show that the proteasome is involved on H1 degradation, as all the H1 variants accumulated in the cytoplasm. The fact that they are not accumulated inside the nucleus without visible effects on chromatin seems to show a regulation to avoid undesired effects on the nucleus. The mechanism of H1 degradation is ubiquitin-independent and mediated by the free 20S proteasome. H1s are recognized through their C-terminal domain due to its intrinsically disordered properties and its positive charges.