Desarrollo de métodos encaminados a mejorar nuestra comprensión sobre los riesgos que supone la exposición a nanoplásticos

Abstract

En els darreres anys la creixent producció i consum de plàstic l'ha convertit en el contaminant mundial més important. Quan els plàstics són alliberats al medi, aquests redueixen la seva mida fins a micro i nanoplàstics (MNPLs). L'omnipresència d'aquestes partícules, i el fet que poden presentar diferents propietats fisicoquímiques, han incrementat la preocupació sobre els riscos pel ambient i per a la salut humana. L'exposició humana als MNPLs es produeix per inhalació, contacte dèrmic i la ingesta d'aliments. Quan els MNPLs ingressen al cos a través de la ingestió, aquests han de passar pels diferents compartiments del tracte gastrointestinal on es poden afectar les seves propietats fisicoquímiques i les característiques de la superfície. Al nostre estudi, per analitzar de manera efectiva la toxicitat dels MNPLs, hem sotmès a una digestió in vitro poliestirè pristí (PSNPLs) i el seu equivalent fluorescent (fPSNPL). Usant diferents metodologies com TEM, SEM i DLS hem determinat que no es van produir canvis en la mida o la superfície de les partícules. Tot i això, les partícules digerides van mostrar una important tendència a l'aglomeració. Mitjançant micro-espectroscòpia confocal Raman (CRM) hem determinat la presència de diferents proteïnes a la seva superfície. Pel que fa a la internalització, els PSNPLs digerits van mostrar una internalització cel·lular més gran que els PSNPLs no digerits en les tres línies cel·lulars analitzades (TK6, Raji-B i THP-1). Tot i aquestes diferències en la captació cel·lular, no es van observar diferències en la producció intracel·lular de ROS, ni en el dany oxidatiu. Finalment, es va detectar la inducció de dany genotòxic, però només a les concentracions més altes i en cèl·lules THP1. Addicional al perill que representen per si sols els MNPLs, aquestes partícules poden adsorbir altres contaminants o metalls pesants de l'ambient, transportar-los i transferir-los a diferents organismes a través de la ingestió, la inhalació i el contacte amb la pell, augmentant potencialment la seva toxicitat. Així, hem avaluat les possibles interaccions entre el nanopoliestirè (PSNPLs) i materials de plata (AgNPs i nitrat de plata) i els seus efectes sobre les cèl·lules intestinals humanes Caco-2. Utilitzant microscòpia TEM-EDX, hem confirmat l'adsorció i la presència del metall als complexos formats. A més, hem detectat que la quantitat de plata (nanoplata i plata iònica) augmenta significativament a mesura que augmenten les concentracions de nanopoliestirè. A través de microscòpia confocal a les cèl·lules Caco-2, hem observat la col·localització de nanopoliestirè/nanoplata als diferents compartiments cel·lulars, inclòs el nucli cel·lular. Tot i la internalització d'aquests complexos a les cèl·lules Caco-2, no es van detectar augments en els nivells de ROS, ni inducció de dany genotòxic de manera dependent de la dosi de nanopoliestirè. El perill dels MNPLs ambientals també augmenta sí durant la seva producció s'hi afegeixen additius per augmentar les propietats dels polímers. Entre els additius mes utilitzats hi ha els metalls. Així, utilitzant ampolles de llet de PET opac que contenen nanopartícules de titani, hem obtingut nanoplàstics PET(Ti)NPLs mitjançant el mètode d'abrasió, desenvolupat al Grup. Aquest tipus de MNPLs amb metalls embeguts a la seva estructura poden ser útils per comprendre la seva destinació quan són internalitzats per organismes complexos. Mitjançant l'ús d'un ampli conjunt d'eines, he caracteritzat aquests PET(Ti)NPLs. A més, es va confirmar la presència de Ti juntament amb les partícules de PET i, mitjançant microscòpia confocal. Mitjançant citometria de flux, vam detectar la internalització dels PET(Ti)NPLs a les tres línies cel·lulars estudiades (TK6, Raji-B i THP-1 ), sent THP1 la que més internalitza. Tot i la internalització cel·lular de les partícules de PET(Ti)NPLs, l'estudi no mostra cap augment en la toxicitat cel·lular, com a enfocament preliminar.

En los últimos años, la creciente producción y consumo de plásticos los ha convertido en el mayor contaminante mundial. Cuando éstos son liberados al ambiente reducen su tamaño convirtiéndose en micro y nanoplásticos (MNPLs). La elevada presencia de estas partículas y el hecho de que pueden presentar diferentes propiedades fisicoquímicas, han incrementado la preocupación sobre sus riesgos en los ecosistemas y en la salud humana. La exposición humana a los MNPLs se puede producir por inhalación, contacto dérmico e ingestión de alimentos. Cuando los MNPLs ingresan al cuerpo a través de la ingestión pasan por las diferentes secciones del tracto gastrointestinal pudiendo afectar a las propiedades fisicoquímicas y características de su superficie. En esta Tesis se ha analizado de manera efectiva la toxicidad de los MNPLs tras la digestión in vitro del poliestireno prístino (PSNPLs) y su equivalente fluorescente (fPSNPL). Usando diferentes metodologías (TEM, SEM y DLS) se ha determinado que no se producen cambios en el tamaño y la superficie de las partículas, aunque las partículas digeridas mostraron una importante tendencia a la aglomeración. Mediante microespectroscopía confocal Raman (CRM) se ha determinado la presencia de diferentes proteínas en su superficie. Adicionalmente, los PSNPLs digeridos mostraron una mayor internalización celular que los no digeridos en las tres líneas celulares utilizadas (TK6, Raji-B y THP-1). A pesar de estas diferencias en la captación celular, no se observaron diferencias en la producción intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS) ni daño oxidativo. Finalmente, se detectó la inducción de daño genotóxico, pero sólo en las concentraciones más altas y en células THP1. Además del riesgo que representan por sí solos los MNPLs, estas partículas pueden adsorber contaminantes o metales pesados del entorno transportándolos y transfiriéndolos a diferentes organismos a través de la ingestión, inhalación y contacto con la piel, aumentando potencialmente su toxicidad. Se han evaluado las posibles interacciones entre el nanopoliestireno (PSNPLs) y la plata, en forma de nanopartículas (AgNPs) e iónica (Ag+), y sus efectos sobre las células intestinales humanas Caco-2. Usando TEM-EDX se ha confirmado la adsorción y la presencia de este metal en los complejos formados, observando que la cantidad de plata aumenta significativamente a medida que aumentan las concentraciones de PSNPLs. Usando microscopía confocal, se ha observado la colocalización de PSNPLs/AgNPs en los diferentes compartimentos de las células Caco-2, incluido su núcleo. A pesar de ello, no se ha detectado aumentos en los niveles de ROS ni inducción de daño genotóxico, de manera dependiente de la dosis de PSNPLs. El peligro de los MNPLs ambientales aumenta si durante su producción se agregan aditivos, como ciertos metales, para mejorar las propiedades de los polímeros. En este estudio hemos usado botellas de leche fabricadas con PET opaco, que contienen nanopartículas de titanio, para obtener nanoplásticos [PET(Ti)-MNPLs], mediante un método de abrasión desarrollado en nuestro Grupo de investigación. Estos MNPLs, con metales integrados en su estructura, resultan muy útiles para averiguar su distribución en el organismos cuando son asimilados por organismos complejos. Los nanoplásticos obtenidos se han caracterizado y se ha confirmado la presencia de Ti junto con las partículas de PET. Después, mediante microscopía confocal y citometría de flujo, se ha estudiado y detectado la internalización del PET(Ti)NPLs en tres líneas celulares (TK6, Raji-B y THP-1), siendo THP1 la más afectada por la exposición. A pesar de la internalización celular de las partículas de PET(Ti)NPLs, nuestros resultados preliminares no muestran ningún efecto sobre la toxicidad celular.

In the past few years, the growing production/consumption of plastic has turned plastics into the world's largest pollutant. When plastics are released into the environment, they reduce their size range into micro/nanoplastics (MNPLs) by the effects of many environmental factors. The ubiquity of these nanoparticles and the fact that they can display different physicochemical properties, compared with their original versions, have raised growing concerns about their risks to the environment and to human health. Human exposure to MNPLs takes place through inhalation, dermal contact, and food ingestion. Once MNPLs enter the human body via ingestion they must pass through different compartments of the gastrointestinal tract that may affect different physicochemical properties and surface features. To effectively analyze the toxicity of MNPLs, we determined the potential effects of in vitro digestion on the physicochemical/biological characteristics of polystyrene nanoplastics (PSNPLs). In our study, an in vitro digestion process was performed on pristine polystyrene (PSNPLs) and on its fluorescent counterpart (fPSNPLs). Using transmission electron microscopy (TEM), scanning electron microscopy (SEM), and dynamic light scattering (DLS) methodologies we have determined that no changes in the size or in their surface were observed. Nevertheless, the digested particles show a relevant tendency to agglomerate, and by using confocal Raman micro-spectroscopy (CRM) we have determined a differential presence of proteins on their surface. Regarding cell uptake, digested PSNPLs showed greater cell uptake than undigested PSNPLs in all three tested cell lines (TK6, Raji-B, and THP-1). Despite these differences in cell uptake, no differences in intracellular ROS production, nor oxidative damage were observed. Finally, genotoxic damage induction was detected but only at the highest concentrations in THP1 cells. In addition to the hazard that MNPLs represent by themselves, these plastic particles can adsorb other pollutants or heavy metals from the environment and, consequently, transport and transfer them to different organisms through ingestion, inhalation, and skin contact, potentially increasing their toxicity. Thus, we evaluated the possible interactions between nanopolystyrene (PSNPLs) and silver materials (AgNPs and silver nitrate) and their effects on human intestinal Caco-2 cells. Using TEM-EDX microscopy, we confirmed the adsorption and the presence of the metal in the formed complexes. Furthermore, we have detected that the amount of silver (nanosilver and ionic silver) increases significantly as nanopolystyrene concentrations increase. Using Caco-2 cells and confocal microscopy, we have observed the co-localization of nanopolystyrene/nanosilver in different cellular compartments, including the cell nucleus. Despite the internalization of these complexes in the Caco-2 cells, no increases in the ROS levels, nor genotoxic damage induction was detected in a dose-dependent manner of nanopolystyrene. The hazard of the environmental MNPLs not only increases if they adsorb contaminants from the environment but, during their production unsafe products, such as additives, are added to increase the properties of the polymers and prolong their life. Among such additives, metals can be pointed out. Accordingly, we used opaque PET milk bottles containing titanium nanoparticles to obtain their derivative nanoplastics [PET(Ti)NPLs] using the degradation method, via sanding, developed in the Group. This type of metal-doped MNPLs can be very useful to understand their fate when internalized by complex organisms. By using a wide set of tools, the obtained PET(Ti)NPLs were extensively characterized. In addition, the presence of Ti together with the PET particles was confirmed, and using confocal microscopy and flow cytometry, we detected the internalization of PET(Ti)NPLs in the three studied cell lines (TK6, Raji-B, and THP-1), being THP1 the one that internalizes the most. Despite the cell internalization of the PET(Ti)NPLs particles, the study does not show any increase in cell toxicity, as a preliminary approach.