Exploring and exploiting multi-domain recombinant proteins as targeted nanomedical tools

Abstract

La nanomedicina busca donar solucions a problemes de salud explotant els avantatges de la nanoescala. Per a arribar al seu lloc d'acció, les eines nanomèdiques han de superar diverses barreres biològiques, com el direccionament cap a les seves cèl·lules diana, que pot donar-se mitjançant la presència de lligands específics a la seva superfície. La tecnologia recombinant permet incorporar regions amb aquesta i altres funcions en proteïnes multidomini amb aplicacions diagnòstiques o terapèutiques, que poden ser produïdes en hostes simples, econòmics i coneguts com Escherichia coli.

El rol de la clàssica cua de purificació H6 ha estat recentment explorat amb altres finalitats biotecnològiques, com la oligomerització que té lloc en nanopartícules proteiques derivades de T22-GFP-H6. Explorar les diferents aplicacions de pèptids rics en His pot contribuir al futur desenvolupament d'aquests materials. Per la seva banda, els nanobodies emergeixen com alternatives simples als anticossos amb el potencial de promoure les seves funcions amb dominis únics. En aquest treball, la seva introducció en proteïnes multidomini amb cues d'histidina ha permès generar entitat funcionals amb els beneficis de l'oligomerització i amb potencials aplicacions biomèdiques. A més, s'han pogut estudiar les múltiples conformacions que presenten aquest tipus de proteïnes, revelant importants conceptes per entendre les seves propietats estructurals i funcionals.

En càncer, les nanopartícules proteiques han estat explorades per dirigir fàrmacs a cèl·lules mare tumorals que sobreexpressen CXCR4, amb un rol important en metàstasi, recaigudes i resistències. Aquí, el sistema ha estat aprofitat per dirigir proteïnes a fibroblasts associats a tumor que sobreexpressen PDGFR-ß (implicats en el desenvolupament i l'agressivitat dels tumors) utilitzant el seu lligand natural PDGFD. A més, nanopartícules antitumorals basades en l'exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa han estat generades amb èxit, amb eficàcia provada in vitro i in vivo.

Tot i les oportunitats ofertes per aquesta plataforma nanomèdica basada en l'ús de dominis de direccionament, oligomerització i terapèutics, el desenvolupament de biofàrmacs innovadors basats en proteïnes amb activitat intracel·lular té en l'atrapament endosomal una barrera crítica que en compromet l'eficàcia. En aquest sentit, pèptids i dominis amb diferents orígens i mecanismes s'alcen com a potencials eines per a superar aquest problema en proteïnes multidomini. Malgrat el domini de translocació de la toxina diftèrica reunia a priori les propietats necessàries per ser un bon candidat, la seva incorporació en una proteïna multidomini dirigida a CXCR4 basada en GFP ha compromès la selectivitat d'aquesta pel receptor, tot i promoure'n l'acumulació intracel·lular.

En els últims anys, l'exploració de nanopartícules proteiques dirigides per a l'entrega de fàrmacs convencionals i proteïnes intrínsecament citotòxiques ha evolucionat en paral·lel, sorgint-ne nombrosos articles i patents. Contemplant un futur clínic d'aquesta tecnologia, la combinació de múltiples activitats terapèutiques en una única entitat farmacològica resulta atractiva per a potenciar-ne l'efecte antitumoral i fer front a resistències. Explotant l'activitat antitumoral mostrada per l'exotoxina A de P. aeruginosa i la toxina diftèrica, nanopartícules proteiques amb cadascun d'aquests dominis han estat respectivament conjugades als fàrmacs clàssics fluxoridina i auristatina E. Aquests novedosos materials amb activitat citotòxica dual són estructuralment factibles, però la unió covalent no-específica limita l'activitat dels dominis proteics. La restricció principal d'aquest concepte ha estat per tant identificada i el desenvolupament de nous materials mitjançant conjugació dirigida esdevé una perspectiva de futur d'aquest treball.

En resum, aquesta tesi reflexa el coneixement obtingut de l'exploració i aprofitament de proteïnes recombinants multidomini com a eines nanomèdiques dirigides. El futur portarà nous reptes que enfrontar, noves oportunitats que prendre i noves dificultats que superar i, tot i que els resultats no siguin sempre els esperats, cada gra de sorra compta.

La nanomedicina busca dar soluciones a problemas de salud explotando las ventajas de la nanoescala. Para alcanzar su lugar de acción, las herramientas nanomédicas deben superar diversas barreras biológicas, como el direccionamiento hacia sus células diana, que puede darse mediante la presencia de ligandos específicos en su superficie. La tecnología recombinante permite incorporar péptidos y dominios con ésta y otras funciones en proteínas multidominio con aplicaciones diagnósticas o terapéuticas, que pueden ser producidas en huéspedes simples, económicos y conocidos como Escherichia coli.

El rol de la clásica cola de purificación H6 ha sido recientemente explorado para otros fines biotecnológicos, como la oligomerización que ocurre en nanopartículas proteicas derivadas de T22-GFP-H6. Explorar las distintas aplicaciones de péptidos ricos en His puede contribuir al futuro desarrollo de estos materiales. Por su parte, los nanobodies emergen como alternativas sencillas a los anticuerpos con el potencial de promover sus funciones con dominios únicos. En este trabajo, su introducción en proteínas multidominio con colas de histidina ha permitido generar entidades funcionales con los beneficios otorgados por la oligomerización y con potenciales aplicaciones biomédicas. Además, se han podido estudiar las múltiples conformaciones que presentan este tipo de proteínas, revelando importantes conceptos para entender sus propiedades estructurales y funcionales.

En cáncer, las nanopartículas proteicas han sido exploradas con anterioridad para dirigir fármacos a células madre tumorales que sobreexpresan CXCR4, con un rol importante en metástasis, recaídas y resistencias. Aquí, el sistema ha sido aprovechado para dirigir proteínas a fibroblastos asociados a tumor que sobreexpresan PDGFR-ß (implicados en el desarrollo y agresividad de los tumores) mediante su ligando natural PDGFD. Además, nanopartículas antitumorales basadas en la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa han sido desarrolladas con éxito, con eficacia probada in vitro e in vivo.

Pese a las oportunidades ofrecidas por esta plataforma nanomédica basada en el uso de dominios de direccionamiento, oligomerización y terapéuticos, el desarrollo de biofármacos innovadores basados en proteínas con actividad intracelular tiene en el atrapamiento endosomal una barrera crítica que compromete su eficacia. En este sentido, péptidos y dominios con distintos orígenes y mecanismos emergen como potenciales herramientas para superar este problema en proteínas multidominio. Aunque el dominio de translocación de la toxina diftérica reunía a priori las propiedades necesarias para ser un buen candidato y promueve el transporte de su dominio catalítico al citosol, su introducción en una proteína multidominio dirigida a CXCR4 basada en GFP ha comprometido su selectividad por el receptor pese a promover su acumulación intracelular.

En los últimos años, la exploración de las nanopartículas proteicas dirigidas para la entrega de fármacos convencionales y proteínas citotóxicas ha evolucionado en paralelo, resultando en numerosos artículos y patentes. Contemplando un futuro uso clínico de esta tecnología, la combinación de múltiples actividades terapéuticas en una única entidad farmacológica resulta atractiva para potenciar el efecto antitumoral y hacer frente a resistencias. Explotando la actividad antitumoral mostrada por la exotoxina A de P. aeruginosa y la toxina diftérica, nanopartículas proteicas con estos dominios han sido respectivamente conjugadas a los fármacos clásicos floxuridina y auristatina E. Estos novedosos materiales con actividad citotóxica dual son estructuralmente factibles, pero la unión covalente no-específica limita la actividad de los dominios proteicos. La restricción principal de este concepto ha sido pues identificada y el desarrollo de nuevos materiales mediante conjugación dirigida emerge como perspectiva de futuro de este trabajo.

En resumen, esta tesis refleja el conocimiento obtenido de la exploración y aprovechamiento de proteínas recombinantes multidominio como herramientas nanomédicas dirigidas. El futuro traerá nuevos retos que enfrentar, nuevas oportunidades que tomar y nuevas dificultades que superar y, aunque los resultados no siempre sean los esperados, cada grano de arena cuenta.

Nanomedicine seeks to provide solutions to healthcare problems exploiting the advantages of being on the nanoscale. To reach their action sites, nanomedical tools need to face several biological barriers, as the recognition and internalization in their target cells, that can be mediated by the presence of active targeting ligands on their surface. Recombinant technology allows the incorporation of peptides and domains with this and other functions in multi-domain proteins with diagnostic or therapeutic applications, which can be produced in simple, cost-effective, and well-known expression hosts, as Escherichia coli.

The role of the classical purification tag H6 has been recently explored for other biotechnological ends, as oligomerization observed for protein nanoparticles derived from T22-GFP-H6. Exploring the different applications of His-rich peptides is a hot spot in the field that may contribute to future development of these materials. For its part, nanobodies emerge as simpler alternatives to full-length antibodies with the potential to exert their functions in single domains. In this work, their introduction in H6-tagged fusion proteins has resulted in the generation of functional entities with the benefits provided by oligomerization and with potential applications in biomedicine. Moreover, nanobody-based His-tagged multi-domain recombinant proteins with multiple conformations have been studied, revealing key concepts for understanding their structural and functional properties.

In the context of cancer, protein nanoparticles have been previously explored for targeting cancer stem cells over-expressing CXCR4, with a crucial role in metastasis, tumor relapse and drug resistance. In here, the system has been exploited for targeting cancer associated fibroblasts over-expressing PDGFR-ß (key stromal cells with an important contribution in the malignant phenotype of tumors) using the ligand PDGFD. Moreover, antitumoral protein nanoparticles based on the exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa have been successfully developed, with proven efficacy in vitro and in vivo (in mice).

Despite the opportunities offered by this nanomedical technology based on targeting, oligomerization and therapeutic domains, the development of innovative biopharmaceuticals based on proteins with intracellular activity has a critical barrier in endosomal entrapment. This event compromises the efficacy of protein-based therapeutic domains and limit their bioavailability. In this sense, peptides and domains with different origins and mechanisms emerge as potential tools to overcome this bottleneck in multi-domain recombinant proteins. Although the diphtheria toxin translocation domain met the required properties for being a good candidate as it efficiently delivers its catalytic partner to the cytosol in targeted approaches, its incorporation in a CXCR4-targeted GFP-based multidomain protein has compromised its selectivity for the receptor despite increasing cytosolic bioavailability.

In the last years, the exploration of targeted protein nanoparticles for the delivery of conventional drugs and as intrinsically cytotoxic therapeutic agents has evolved in parallel and has resulted in several research articles and patents. Envisaging a future clinical use in oncology of this technology, the combination of multiple therapeutic activities in a single pharmacologic entity becomes an attractive tool to enhance antitumor effect and overcome resistances. Exploiting the antitumoral activity shown by P. aeruginosa exotoxin A and Corynebacterium diphtheriae toxin, protein nanoparticles comprising these domains have been respectively conjugated to conventional chemotherapeutics as floxuridine or monomethyl auristatin E. These novel dual-acting cytotoxic materials are structurally feasible, but non-specific covalent conjugation limits protein-based activity. The bottleneck of this technique has been identified and developing dual-acting site-directed nanoconjugates emerge as a future perspective of this work.

In summary, this thesis reflects the knowledge obtained from exploring and exploiting multi-domain recombinant proteins as targeted nanomedical tools. Future will bring new challenges to face, new opportunities to take, and new hurdles to overcome and, although outcomes may not always meet expectation, every grain of sand counts.