Development of a new methodology for the study of the three-dimensional (epi)genetic landscape in human normal and malignant hematopoiesis

Abstract

L'estructura tridimensional de la cromatina és una característica clau en la regulació del control de l'expressió gènica. Comprendre les interaccions de llarg abast entre els promotors gènics i els elements reguladors, com els enhancers, és crucial per comprendre l'estreta interacció en el control transcripcional dels gens esmentats i, si s'altera, pot donar lloc a malalties, incloses neoplàsies hematopoètiques. Tot i això, els mètodes convencionals d'estudi exigeixen grans quantitats de material de partida, cosa que resulta poc pràctica per als escenaris clínics i l'anàlisi de poblacions cel·lulars poc freqüents. Per abordar aquesta qüestió, en aquesta tesi hem desenvolupat un mètode rendible i flexible anomenat Low Input Capture Hi-C (liCHi-C), que permet el mapeig detallat i la comparació d'interactomes de promotors a alta resolució utilitzant tan sols 50.000 cèl·lules.

Per demostrar la seva versatilitat, hem aplicat liCHi-C per investigar la jerarquia hematopoètica humana normal i maligna utilitzant mostres clíniques. A través d'aquest mètode, hem revelat l'arquitectura dinàmica dels promotors durant l'hematopoesi humana, que ajuda a identificar les vies de desenvolupament i regeix els canvis transcripcionals durant el compromís del destí cel·lular. A més, liCHi-C ha mostrat ser vàlid per identificar tipus cel·lulars, gens i vies rellevants per a malalties que es poden veure afectats per alteracions no codificants en elements reguladors distals.

Finalment, hem demostrat el potencial de liCHi-C per descobrir variants estructurals a tot el genoma, determinar-ne els punts de ruptura i inferir-ne els possibles efectes patogènics. El nostre mètode optimitzat liCHi-C amplia enormement l'exploració de l'organització tridimensional de la cromatina a poblacions cel·lulars escasses, oferint l'oportunitat de descobrir factors clau i xarxes reguladores implicades en la patogènesi de malalties.

La estructura tridimensional de la cromatina es una característica clave en la regulación del control de la expresión génica. Comprender las interacciones de largo alcance entre los promotores génicos y los elementos reguladores, como los enhancers, es crucial para comprender la estrecha interacción en el control transcripcional de dichos genes y, si se altera, puede dar lugar a enfermedades, incluidas neoplasias hematopoyéticas. Sin embargo, los métodos convencionales de estudio exigen grandes cantidades de material de partida, lo que resulta poco práctico para los escenarios clínicos y el análisis de poblaciones celulares poco frecuentes. Para abordar esta cuestión, en la presente tesis hemos desarrollado un método rentable y flexible denominado Low Input Capture Hi-C (liCHi-C), que permite el mapeo detallado y la comparación de interactomas de promotores a alta resolución utilizando tan solo 50.000 células.

Para demostrar su versatilidad, hemos aplicado liCHi-C para investigar la jerarquía hematopoyética humana normal y maligna utilizando muestras clínicas. A través de este método, hemos revelado la arquitectura dinámica de los promotores durante la hematopoyesis humana, que ayuda a identificar las vías de desarrollo y rige los cambios transcripcionales durante el compromiso del destino celular. Además, liCHi-C ha demostrado ser válido para identificar tipos celulares, genes y vías relevantes para enfermedades que pueden verse afectados por alteraciones no codificantes en elementos reguladores distales.

Además, hemos demostrado el potencial de liCHi-C para descubrir variantes estructurales en todo el genoma, determinar sus puntos de ruptura e inferir sus posibles efectos patogénicos. Nuestro método optimizado liCHi-C amplía enormemente la exploración de la organización tridimensional de la cromatina a poblaciones celulares escasas, ofreciendo la oportunidad de descubrir factores clave y redes reguladoras implicadas en la patogénesis de enfermedades.

The three-dimensional structure of chromatin is a key feature in the regulation of gene expression control. Understanding long-range interactions between gene promoters and regulatory elements, such as enhancers, is crucial to comprehend the tight interplay in the transcriptional control of said genes and, if altered, can lead to disease including hematopoietic malignancies. However, the conventional methods of study demand large amounts of starting material which is impractical for clinical scenarios and the examination of rare cell populations. To address this, in the present thesis we have developed a cost-effective and flexible method called Low Input Capture Hi-C (liCHi-C), which enables the detailed mapping and comparison of promoter interactomes at high resolution using as little as 50,000 cells.

To demonstrate its versatility, we applied liCHi-C to investigate both normal and malignant human hematopoietic hierarchy using clinical samples. Through this method, we revealed the dynamic architecture of promoters during human hematopoiesis, which helps identify developmental pathways and governs transcriptional changes during cellular fate commitment. Furthermore, liCHi-C proved valuable in pinpointing disease-relevant cell types, genes and pathways that may be affected by non-coding alterations in distal regulatory elements.

Additionally, we demonstrated liCHi-C's potential in uncovering genome-wide structural variants, determining their breakpoints and inferring their potential pathogenic effects. Our optimized liCHi-C method greatly expands the exploration of 3D chromatin organization to scarce cell populations, offering an opportunity to discover key factors and regulatory networks involved in disease pathogenesis.