Simultaneous activation of two complementary targets, Kv7.2/3 AND TSPO: a novel treatment for amyotrophic lateral sclerosis

Abstract

L'esclerosi lateral amiotròfica (ELA) és una malaltia neurodegenerativa mortal caracteritzada per la degeneració progressiva de les motoneurones (MN) a la còrtex motora i medul·la espinal. Això porta a debilitat muscular, paràlisi i la mort en un període de 2 a 5 anys després de l'inici de la malaltia. Els mecanismes exactes que desencadenen la degeneració de les MN a l'ELA segueixen sent desconeguts; no obstant, es creu que el procés neurodegeneratiu resulta de la combinació de diversos mecanismes patogènics. L'enfocament terapèutic tradicional ha estat centrat en tractar una sola via patogènica, la qual cosa ha portat a una efectivitat limitada en la millora de l'ELA. Per tant, s'estan buscant enfocaments terapèutics nous i combinats. L'objectiu d'aquesta tesi ha estat avaluar el potencial terapèutic de l'activació simultània de dos targets diferents, els canals de potassi regulats per voltatge 7.2/3 (Kv7.2/3) i la proteïna translocadora mitocondrial (TSPO), com un tractament prometedor per millorar el curs de l'ELA. Es va provar el nou medicament GRT-X de mecanisme dual en un model in vitro de cultiu organotípic espinal (SCOCs en anglès) i després en el model murí de l'ELA, els ratolins transgènics SOD1G93A. Primer, vam avaluar l'activació de Kv7.2/3 mitjançant el compost selectiu ICA-27243. Els nostres resultats van revelar que ICA-27243 prevé la degeneració de les MN en SCOCs exposats a excitotoxicitat. A més, l'administració intraperitoneal de ICA-27243 als ratolins SOD1G93A va millorar la funció neuromuscular, va mantenir la locomoció i coordinació, va reduir la mort de les NM a la medul·la espinal i va atenuar la reactivitat de les cèl·lules glials, la qual cosa suggereix que és un tractament efectiu per prevenir la progressió de l'ELA. Posteriorment, vam demostrar que GRT-X augmenta la supervivència de les MN tant en SCOCs com en cultius de MN aïllats exposats a la toxicitat induïda per un medi condicionat d'astrocits (ACM en anglès) derivat d'astrocits de ratolins que sobreexpressen la proteïna SOD1 humana mutada (SOD1G93A-ACM) o d'astrocits generats a partir de cèl·lules mare pluripotents induïdes de pacients d'ELA portadors de mutacions causants de la malaltia en els gens SOD1 (SOD1D90A-ACM) o TDP43 (TDP43A90V-ACM). A més, vam identificar que un dels mecanismes involucrats en l'augment de la supervivència de les NM mitjançant GRT-X és la reducció en els nivells de ROS. In vivo, l'administració oral diària del compost GRT-X als ratolins SOD1G93A va preservar la funció neuromuscular i l'activitat motora. Els estudis histològics van demostrar que GRT-X va millorar la supervivència de les MN i la innervació de la unió neuromuscular als ratolins SOD1G93A tractats. No obstant, els efectes de GRT-X van mostrar algunes diferències entre els sexes, sent més efectiu en les femelles que en els mascles tractats. Aquests dades van demostrar l'eficàcia de GRT-X per al tractament de malalties degeneratives de les MN. Finalment, vam explorar el potencial sinèrgic dels dos targets avaluats en aquesta tesi. Així, vam utilitzar simultàniament els agonistes unimodals de cada target, ICA-27243 per a Kv7.2/3 i Olesoxime per a TSPO. Els estudis in vitro en SCOCs van demostrar un efecte sinèrgic de totes dues vies, ja que la supervivència de les MN va ser major amb el tractament dual que amb els tractaments individuals. Tot i això, els efectes sinèrgics observats in vitro no es van traduir a condicions in vivo, malgrat que aquesta combinació també va millorar l'evolució de la funció neuromuscular i va augmentar la supervivència de les MN als ratolins SOD1G93A. En conjunt, els resultats d'aquesta tesi van proporcionar evidència que TSPO i Kv7.2/3 són targets prometedors per a l'ELA i van demostrar que GRT-X, i també ICA-27243, exerceixen accions neuroprotectores per a l'ELA.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa mortal caracterizada por la degeneración progresiva de las neuronas motoras (MN) en la corteza motora y médula espinal, lo que conduce a debilidad muscular, parálisis y la muerte en el periodo de 2 a 5 años después del inicio de la enfermedad. Los mecanismos exactos que desencadenan la degeneración de las MN en la ELA siguen siendo desconocidos; sin embargo, se cree que el proceso neurodegenerativo resulta de la combinación de varios mecanismos patogénicos. El enfoque terapéutico tradicional ha estado centrado en tratar una sola vía patogénica, lo que ha conducido a una efectividad limitada en la mejora de la ELA. Por tanto, se están buscando enfoques terapéuticos novedosos y combinados. El objetivo de esta tesis ha sido evaluar el potencial terapéutico de la activación simultánea de dos targets diferentes, los canales de potasio regulados por voltaje 7.2/3 (Kv7.2/3) y la proteína translocadora mitocondrial (TSPO), como un enfoque prometedor para mejorar el curso de la ELA. Se probó el nuevo medicamento GRT-X de mecanismo dual en un modelo in vitro de cultivo organotípico espinal (SCOCs en inglés) y luego en el modelo murino de ELA, los ratones transgénicos SOD1G93A. Primero, evaluamos la activación de Kv7.2/3 mediada por el compuesto selectivo ICA-27243. Nuestros resultados revelaron que ICA-27243 previene la degeneración de las MN en SCOCs expuestos a excitotoxicidad. Además, la administración intraperitoneal de ICA-27243 a los ratones SOD1G93A mejoró la función neuromuscular, mantuvo la locomoción y coordinación, redujo la muerte de las MN en la médula espinal y atenuó la reactividad de las células gliales, lo que sugiere que es un tratamiento efectivo para prevenir la progresión de la ELA. Posteriormente, demostramos que GRT-X aumenta la supervivencia de las MN tanto en SCOCs como en cultivos de MN aislados expuestos a la toxicidad inducida por un medio condicionado de astrocitos (ACM en inglés) derivado de astrocitos de ratones que sobreexpresan la proteina SOD1 humana mutada (SOD1G93A-ACM) o de astrocitos generados a partir de células madre pluripotentes inducidas de pacientes de ELA portadores de mutaciones causantes de la enfermedad en los genes SOD1 (SOD1D90A-ACM) o TDP43 (TDP43A90V-ACM). Además, se identificó que uno de los mecanismos involucrados en el aumento de la supervivencia de las MN mediante GRT-X es la reducción en los niveles de ROS. In vivo, la administración oral diaria del compuesto GRT-X a los ratones SOD1G93A preservó la función neuromuscular y la actividad motora. Los estudios histológicos demostraron que GRT-X mejoró la supervivencia de las MN y la inervación de la unión neuromuscular en los ratones SOD1G93A tratados. Sin embargo, los efectos de GRT-X mostraron algunas diferencias entre los sexos, siendo más efectivo en las hembras que en los machos tratados. Estos datos demostraron la efectividad de GRT-X para el eventual tratamiento de enfermedades degenerativas de las MN. Finalmente, se exploró el potencial sinérgico de los dos targets evaluados en esta tesis. Así, utilizamos simultáneamente los agonistas unimodales de cada target, ICA-27243 para Kv7.2/3 y Olesoxime para TSPO. Estudios in vitro en SCOCs demostraron un efecto sinérgico de ambas vías, ya que la supervivencia de las MN fue mayor con el tratamiento dual que con los tratamientos individuales. Sin embargo, los efectos sinérgicos observados in vitro no se tradujeron a condiciones in vivo, a pesar de que esta combinación también mejoró la evolución de la función neuromuscular y aumentó la supervivencia de las MN en los ratones SOD1G93A. En conjunto, los resultados de esta tesis proporcionaron evidencia de que TSPO y Kv7.2/3 son objetivos prometedores para la ELA y demostraron que GRT-X, y también ICA-27243, ejercen acciones neuroprotectoras para la ELA.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), the most frequent motor neuron disease (MND) in adults, is a fatal neurodegenerative disease characterized by the progressive degeneration of motoneurons (MNs) in the motor cortex and spinal cord, leading to muscle weakness and paralysis, and death within 2­5 years after the disease onset. The exact mechanisms triggering MN degeneration in ALS remain elusive; however, it is suggested that the neurodegenerative process results from the combination of several pathogenic mechanisms. Most assays are focused on treating a single pathogenic pathway involved, leading to limited effectiveness in improving ALS. Therefore, novel and combinatorial therapeutic approaches are currently being pursued. The aim of this thesis was to assess the therapeutic potential of the simultaneous activation of two different targets, the voltage­gated potassium channels 7.2/3 (Kv7.2/3) and the mitochondrial translocator protein (TSPO), as a promising approach to improve the course of ALS. For this purpose, we tested the novel and dual­mechanism GRT­X drug in an in vitro model of spinal organotypic culture (SCOC), and then, in the murine ALS model the transgenic SOD1G93A mice. Considering that the neuroprotective effects of TSPO activation in the SOD1G93A mice had been already demonstrated, we first tested the activation of Kv7.2/3 mediated by the selective compound ICA­27243 as a potential therapy. Our findings revealed that ICA­27243 prevents MN degeneration in SCOCs exposed to excitotoxicity. Additionally, intraperitoneal administration of ICA­27243 to the transgenic SOD1G93A mice enhanced neuromuscular function, maintained locomotion and coordination, reduced spinal MN death and attenuated glial reactivity, suggesting it is an effective treatment to prevent the progression of ALS. We then demonstrated that GRT­X increases MN survival in both SCOCs and isolated MN cultures exposed to toxicity induced by astrocyte­conditioned medium (ACM) derived from primary mouse astrocytes expressing mutant human SOD1 (SOD1G93A­ACM) or from ALS astrocytes generated from induced pluripotent stem cells of patients carrying disease­causing mutations of SOD1 (SOD1D90A­ACM) or TDP43 (TDP43A90V­ACM) genes. Furthermore, we found that one of the mechanisms involved in enhancement of MN survival by GRT­X is reduction in ROS levels. In vivo, daily oral administration of the GRT­X compound to SOD1G93A mice preserved neuromuscular function, and motor activity determined by electrophysiology, rotarod and treadmill tests. Histological studies proved that GRT­X enhanced MN survival and neuromuscular junction innervation in treated SOD1G93A mice. However, the effects of GRT­X showed some differences between sexes, being more marked in female than in male­treated mice. These data proved the effectiveness of GRT­X for the eventual treatment of MN degenerative diseases. Finally, we explored the synergistic potential of the two molecular targets assessed in this thesis. Thus, we simultaneously used the unimodal agonists of each target, ICA­27243 for Kv7.2/3 and Olesoxime for TSPO. In vitro studies in spinal cord slices demonstrated a synergistic effect of both pathways since MN survival was higher with the dual than with single treatments. However, the synergistic effects observed in vitro were not translated to in vivo conditions, despite this combination also improved the evolution of neuromuscular function and enhanced MN survival in the SOD1G93A mice. Collectively, the results of this thesis provided evidence that TSPO and Kv7.2/3 are promising targets for ALS and proved that GRT­X, and also ICA­27243, exert neuroprotective actions for ALS.