Born to be bound: Intermolecular interactions and thermodynamics in RNA folding

Autor/a

Aspas Cáceres, Jaime

Director/a

Ritort Farran, Fèlix

Pastor del Campo, Isabel

Tutor/a

Franzese, Giancarlo

Data de defensa

2024-05-15

Pàgines

189 p.



Departament/Institut

Universitat de Barcelona. Facultat de Física

Resum

[eng] This thesis focuses on RNA, one of the most versatile molecules in biological systems, and how intermolecular interactions with ions and proteins govern RNA folding. On its way to biological function, RNA transits a multidimensional thermodynamic pathway that shaping its diverse structural levels. Following an empirical philosophy, single-molecule experimental techniques are combined to observe RNA's exploration of conformational space. Physics allows us to characterize the energies involved in the RNA folding endeavor. The system chosen as a model for this study is the minimal binding site for protein S15 in the 16S ribosomal RNA subunit of E. Coli ribosome. In its minimal energy configuration or native state, this RNA segment adopts a three-way junction (3WJ) over other misfolded structures. The folding free energy of the native secondary structure under different ionic conditions and temperatures is obtained by single-molecule force spectroscopy (smFS) and the application of fluctuations theorems (FTs) from non-equilibrium physics. This allows us to estimate thermodynamic potentials as free energy, enthalpy, and entropy, as well as characterize specific binding effects of divalent cations as Mg2+ and Ca2+ to the 3WJ. At the next level of structure, single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) enables real-time observation of the 3WJ's dynamics, revealing a two-state system where two of the 3WJ helices fold upon binding divalent cations or S15 protein. This allows us to estimate the tertiary structure folding energies of the 3WJ. Finally, smFS and smFRET techniques are combined to study the 3WJ-S15 complex. Mechanical dissociation of the complex by optical and magnetic tweezers serves to estimate its specific binding energy to the RNA, as well as to identify the binding site of the protein with nucleotide resolution. Mutations on the junction, alongside smFRET observations, prove that the same bases binding S15 are responsible for the junction formation. This RNA-protein interaction between S15 and the 16S rRNA 3WJ is one of the early steps of ribosome assembly. Also, it happens on a nucleotide sequence highly conserved between species, indicating the high specificity of the interaction. RNA plays a role in a huge variety of biological scenarios, from structural to enzymatic functions. Nature has provided RNA with such plasticity that it makes it possible for it to function at different scales at the same time. Throughout this work, different biophysical techniques joint efforts to discern the energies involved at each level of folding, serving as a methodology to unravel the secrets of RNA folding through experimentation.


[spa] Esta tesis se centra en el ARN, una de las moléculas más versátiles en los sistemas biológicos, y en cómo las interacciones intermoleculares con iones y proteínas gobiernan el plegamiento del ARN. En su camino hacia la función biológica, el ARN transita un camino termodinámico multidimensional que da forma a sus diferentes niveles estructurales. Siguiendo una filosofía empírica, se combinan técnicas experimentales de molécula única para observar cómo el ARN explora el espacio conformacional. La Física nos permite caracterizar las energías involucradas en el plegamiento del ARN. El sistema elegido como modelo para este estudio es el sitio mínimo de unión para la proteína S15 en la subunidad ribosomal 16S del ribosoma de E. Coli. En su configuración de energía mínima o estado nativo, este segmento de ARN adopta una estructura en la que tres hélices intersecan (3WJ), sobre otras estructuras mal plegadas. La energía libre de plegamiento de la estructura secundaria nativa bajo diferentes condiciones iónicas y temperaturas se obtiene mediante espectroscopía de fuerza de molécula única (smFS) y la aplicación de teoremas de fluctuación (FTs) de la Física fuera del equilibrio. Esto nos permite estimar potenciales termodinámicos como la energía libre, entalpía y entropía, así como caracterizar los efectos de unión específicos de cationes divalentes como Mg2+ y Ca2+ a la 3WJ. En el siguiente nivel de estructura, la ténica de transferencia de energía por resonancia de Förster en molécula única (smFRET) permite la observación en tiempo real de la dinámica de la 3WJ, revelando un sistema de dos estados donde dos de las hélices de la 3WJ se pliegan gracias a la unión de cationes divalentes o de la proteína S15. Esto nos permite estimar las energías de plegamiento de la estructura terciaria de la 3WJ. Finalmente, las técnicas smFS y smFRET se combinan para estudiar el complejo 3WJ-S15. La disociación mecánica del complejo mediante pinzas ópticas y magnéticas sirve para estimar su energía de unión específica al ARN, así como para identificar el sitio de unión de la proteína con resolución de un nucleótido. Mutaciones en el sitio de unión, junto con observaciones de smFRET, demuestran que las mismas bases que se sirven para la unión de S15 son las responsables de la formación de la 3WJ. Esta interacción ARN-proteína entre S15 y la 3WJ de ARN ribosomal 16S es uno de los primeros pasos de ensamblaje del ribosoma. Además, ocurre en una secuencia de nucleótidos altamente conservada entre especies, lo que indica la alta especificidad de la interacción. El ARN juega un papel en una gran variedad de escenarios biológicos, desde funciones estructurales hasta enzimáticas. La naturaleza ha proporcionado al ARN una plasticidad tal que le permite funcionar a diferentes escalas al mismo tiempo. A lo largo de este trabajo, diferentes técnicas biofísicas unen esfuerzos para discernir las energías involucradas en cada nivel de plegamiento, sirviendo como una metodología para desentrañar los secretos del plegamiento del ARN mediante la experimentación.

Paraules clau

RNA; ARN; Espectroscòpia d'electrons; Espectroscopía electrónica; Electron spectroscopy; Microscòpia de fluorescència; Microscopía de fluorescencia; Fluorescence microscopy

Matèries

62 - Enginyeria. Tecnologia

Àrea de coneixement

Ciències Experimentals i Matemàtiques

Nota

Programa de doctorat en Física

Documents

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Drets

L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/
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