Calcium released by dying neurons mediates Iba-1-dependent polarization and motility of microglial cells in parkinsonian neurodegeneration

Abstract

La malaltia de Parkinson és un trastorn neurodegeneratiu caracteritzat per la pèrdua de neurones dopaminèrgiques, específicament a la Substantia Nigra, la qual cosa provoca deteriorament i símptomes motors característics. En un escenari de neurodegeneració parkinsoniana, proposem que les neurones degenerant-se alliberen calci a l'espai extracel·lular, podent contribuir a la resposta neuroimmune. En especial, plantegem la hipòtesi que aquest calci alliberat provoca canvis a la microglíia, la qual cosa en pot promoure la polarització i la motilitat. Experiments in vitro realitzats amb cèl·lules microglials van revelar que la microglia internalitza i uneix el calci extracel·lular i, en conseqüència, modifica la seva morfologia i augmenta el moviment. In vivo, l'administració de calci a l'estriat, així com un quelant de Ca2+, en ratolins C57BL/6j ens va permetre observar lleugers canvis en la morfologia de la microglia entre els animals injectats amb Ca2+ i els controls, però no prou com per considerar la injecció de calci de significativa citotoxicitat. No obstant això, en mesurar la polarització de la micròglia sobre la base del nombre total de branques orientades cap a la font de calci o cap al costat oposat, trobem clares diferències en comparació amb els animals injectats amb salí. Així és, la difusió del calci a través del parènquima cerebral va induir una clara polarització de les branques cap al lloc de la injecció, mentre que això no passava amb solució salina. Sabent que Iba-1 és una proteïna que uneix calci i és específica de microglia i macròfags, la nostra hipòtesi és que Iba-1 podria ser un factor crucial promovent aquests canvis de polarització quan es detecten senyals de calci. En aquest context, quan la micròglia s'exposa a diferències de Ca2+ extracel·lular, augmenta la seva expressió d'Iba-1. A més, la microglia activa augmenta la seva expressió d'Iba-1 coincidint amb F-actina, una proteïna implicada en la formació del citoesquelet, la qual cosa suggereix la implicació d'Iba-1 en la reorganització del citoesquelet per adoptar una morfologia cinètica i després moure's. Finalment, per determinar la implicació d'Iba-1 en la motilitat microglial, es van realitzar injeccions intracranials de calci en ratolins sense Iba-1. Aquests ratolins Aif1-/- van mostrar una capacitat de polarització de branques molt menor a causa de la manca d'Iba-1. Aquests resultats suggereixen una nova interacció entre les neurones dopaminèrgiques en estat degeneratiu i la microglia veïna en què respostes específiques dependents de Ca2+ poden contribuir a la resposta inflamatòria específica en àrees de neurodegeneració parkinsoniana, la qual sembla ser dependent d'Iba-1.

La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la pérdida de neuronas dopaminérgicas, específicamente en la Substantia Nigra, lo cual provoca deterioro y síntomas motores característicos. En un escenario de neurodegeneración parkinsoniana, proponemos que las neuronas degenerándose liberan calcio al espacio extracelular, pudiendo contribuir en la respuesta neuroinmune. En especial, planteamos la hipótesis de que este calcio liberado provoca cambios en la microglia, lo cual puede promover su polarización y motilidad. Experimentos in vitro realizados con células microgliales revelaron que la microglía internaliza y une el calcio extracelular y, en consecuencia, modifica su morfología y aumenta su movimiento. In vivo, la administración de calcio en el estriado, así como un quelante de Ca2+, en ratones C57BL/6j nos permitió observar ligeros cambios en la morfología de la microglia entre los animales inyectados con Ca2+ y los controles, pero no lo suficiente como para considerar la inyección de calcio de significativa citotoxicidad. Sin embargo, al medir la polarización de la microglia en base a número total de ramas orientadas hacia la fuente de calcio o hacia el lado opuesto, encontramos claras diferencias en comparación con los animales inyectados con salino. Así es, la difusión del calcio a través del parénquima cerebral indujo una clara polarización de las ramas hacia el lugar de la inyección, mientras que esto no ocurría con solución salina. Sabiendo que Iba-1 es una proteína que une calcio y es específica de microglía y macrófagos, nuestra hipótesis es que Iba-1 podría ser un factor crucial promoviendo estos cambios de polarización cuando se detectan señales de calcio. En este contexto, cuando la microglia se expone a diferencias de Ca2+ extracelular, aumenta su expresión de Iba-1. Además, la microglia activa aumenta su expresión de Iba-1 coincidiendo con F-actina, una proteína implicada en la formación del citoesqueleto, lo cual sugiere la implicación de Iba-1 en la reorganización del citoesqueleto para adoptar una morfología cinética y después moverse. Finalmente, para determinar la implicación de Iba-1 en la motilidad microglial, se realizaron inyecciones intracraneales de calcio en ratones carentes de Iba-1. Estos ratones Aif1-/- mostraron una capacidad de polarización de ramas mucho menor debido a la falta de Iba-1. Estos resultados sugieren una nueva interacción entre las neuronas dopaminérgicas en estado degenerativo y la microglia vecina en la que respuestas específicas dependientes de Ca2+ pueden contribuir a la respuesta inflamatoria específica en áreas de neurodegeneración parkinsoniana, la cual parece ser dependiente de Iba-1.

Parkinson's disease is a neurodegenerative disorder in which the loss of dopaminergic neurons, specifically in the Substantia Nigra, causes characteristic motor symptoms and deterioration. Focusing on studying the specific parkinsonian neurodegeneration, we propose that dying neurons release calcium to the extracellular space that may contribute to the neuroimmune response. Particularly, we hypothesize that this released calcium provokes changes in microglial cells which may signal their polarization and motility. Our in vitro experiments performed with microglial cells, revealed that microglia internalizes and binds extracellular calcium and in consequence modify their shape and increase their movement. In vivo, administration of calcium to the striatum, as well as a Ca2+ chelator, in C57BL/6j mice allowed us to observe slight changes in the morphology parameters of microglial cells between the Ca2+-injected animals and the controls, but not enough to consider significant cytotoxicity due to the injections. However, when measured the polarization of microglial cells in terms of total number of branches oriented either towards the calcium source or to the opposite side, we found clear differences when compared to saline. Thus, calcium diffusion through the parenchyma induced a clear polarization of microglial branches towards the injection site while the saline seemed to remain unpolarized. Knowing that Iba-1 is a calcium binding protein specific for microglia and macrophages, we hypothesize that Iba-1 may be a crucial factor leading these polarizing changes occurred when they sense calcium changes. In this context, microglial cells, when exposed to extracellular Ca2+ inputs, were analyzed to increase their Iba-1 expression. Furthermore, activated microglial cells increase their expression of Iba-1 coinciding with the well-known cytoskeleton formation protein F-actin, suggesting the implication of Iba-1 in the rearrangement of the cytoskeleton to adapt a kinetic shape for later motility. To finally ascertain the implication of Iba-1 in microglial motility, intracranial injections of calcium were performed in Iba-1 lacking mice. These Aif1-/- mice showed their capacity of branches polarization impaired due to the lack of Iba-1. These results suggest a novel interplay between dying dopaminergic neurons and neighboring microglial cells in which specific Ca2+-dependent responses may contribute to the specific inflammatory response in areas of parkinsonian neurodegeneration which seemed to be Iba-1-dependent.