Development of novel chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapies for lymphoma

Abstract

Les cèl·lules-T amb receptor d'antigen quimèric (CAR-T) combinen l'especificitat d'un anticòs monoclonal amb la capacitat de transducció de senyals d'una cèl·lula T, el que els permet reconèixer i eliminar les cèl·lules tumorals. Tot i que els CARs dirigits contra l'antigen CD19 (CAR19) han estat els més estudiats fins a la data, s'estan desenvolupant cada vegada més noves teràpies contra altres antígens com CD30 (CAR30). Malgrat l'èxit mostrat en els últims anys, encara hi ha marge de millora en l'eficàcia de les cèl·lules CAR-T, ja que encara hi ha molts pacients que no se'n beneficien d'aquesta teràpia. Contra el limfoma, menys del 50% dels pacients aconsegueixen control a llarg termini de la malaltia. Això pot deure's a diferents factors, incloent la immunosupressió, la resistència intrínseca del tumor o la disfunció i manca de persistència de les cèl·lules CAR-T. Per això, el nostre objectiu és desenvolupar teràpies CAR-T optimitzades per al tractament de pacients amb limfoma de Hodgkin clàssic (cHL) i limfoma no-Hodgkin de cèl·lules-B (B-NHL) refractaris, actualment amb pronòstic desfavorable. En aquest sentit, alguns tipus de CARs de quarta generació tenen el potencial de modificar el microambient tumoral (TME) immunosupressor. La primera part d'aquesta Tesi estudia els efectes d'un CAR30 de quarta generació basat en el nostre CAR30 de segona generació prèviament desenvolupat. XX és un lligand inhibidor expressat per les cèl·lules tumorals de cHL i cèl·lules immunosupressores presents en el TME. Així, el nou CAR30 incorpora l'expressió d'un "switch receptor" que combina el reconeixement del lligand inhibitori XX i l'activitat coestimuladora de CD28 (XXR28), per convertir aquesta senyal inhibitòria en activació de la cèl·lula T i millorar així l'activitat antitumoral de CAR30-T al reduir parcialment la immunosupressió derivada del cHL. En resum, el CAR30 de quarta generació va induir una major secreció de citocines de tipus Th1 i una capacitat citotòxica més prolongada in vitro, en comparació amb els de segona i tercera generació, el qual combina els mateixos dominis coestimuladors (4-1BB i CD28). A més, es va demostrar un major efecte antitumoral del CAR30 de quarta generació en un model xenògraf murí de cHL. Cal destacar que els resultats presentats en aquesta Tesi permetran el desenvolupament d'un assaig clínic amb cèl·lules CAR30BBz-XXR28-T de quarta generació enriquides en memòria per al tractament de cHL refractari, possiblement en un futur proper. La segona part d'aquesta Tesi avalua un CAR19 de quarta generació que indueix la secreció constitutiva de YY. Encara que YY és una citocina immunomoduladora amb múltiples efectes en diferents cèl·lules del TME, ens centrem en aquells observats sobre les cèl·lules CAR19-T. Breument, es va demostrar una major composició de cèl·lules-T de memòria amb el CAR19 de quarta generació en comparació amb el de segona generació prèviament desenvolupat, així com una millor expansió, secreció d'IFN-[Gamma] i capacitat citotòxica de les cèl·lules CAR19-T. En conclusió, els nostres resultats suggereixen que la secreció constitutiva de YY per part de les cèl·lules CAR19-T pot reduir la disfunció d'aquestes cèl·lules i estableixen les bases per a la realització de nous estudis amb aquest constructe.

Las células-T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T) combinan la especificidad de un anticuerpo monoclonal con la capacidad transductora de señales de una célula-T, lo que les permite reconocer y eliminar las células tumorales. Aunque los CARs dirigidos contra el antígeno CD19 (CAR19) han sido los más estudiados hasta la fecha, se están desarrollando cada vez más nuevas terapias contra otros antígenos como CD30 (CAR30). A pesar del éxito mostrado en los últimos años, aún existe margen de mejora en la eficacia de las células CAR-T, pues todavía hay muchos pacientes que no se benefician de esta terapia. Contra linfoma, menos del 50% de los pacientes logran control a largo plazo de la enfermedad. Esto puede deberse a diferentes factores, incluyendo la inmunosupresión, la resistencia intrínseca del tumor o la disfunción y falta de persistencia de las células CAR-T. Por ello, nuestro objetivo es desarrollar terapias CAR-T optimizadas para el tratamiento de pacientes con linfoma de Hodgkin clásico (cHL) y linfoma no-Hodgkin de células-B (B-NHL) refractarios, actualmente con pronóstico desfavorable. En este sentido, algunos tipos de CARs de cuarta generación tienen el potencial de modificar el microambiente tumoral (TME) inmunosupresor. La primera parte de esta Tesis estudia los efectos de un CAR30 de cuarta generación basado en nuestro CAR30 de segunda generación previamente desarrollado. XX es un ligando inhibidor expresado por las células tumorales de cHL y células inmunosupresoras presentes en el TME. Así, el nuevo CAR30 incorpora la expresión de un "switch receptor" que combina el reconocimiento del ligando inhibitorio XX y la actividad co-estimuladora de CD28 (XXR28), para convertir esta señal inhibitoria en activación de la célula-T y mejorar así la actividad antitumoral de CAR30-T al reducir parcialmente la inmunosupresión derivada del cHL. En resumen, el CAR30 de cuarta generación indujo mayor secreción de citoquinas de tipo Th1 y una capacidad citotóxica más prolongada in vitro, en comparación con los de segunda y tercera generación, que combina los mismos dominios co-estimuladores (4-1BB y CD28). Además, se demostró un mayor efecto antitumoral del CAR30 de cuarta generación en un modelo xenógrafo murino de cHL. Cabe destacar que los resultados presentados en esta Tesis permitirán el desarrollo de un ensayo clínico con células CAR30BBz-XXR28-T de cuarta generación enriquecidas en memoria para el tratamiento de cHL refractario, posiblemente en un futuro cercano. La segunda parte de esta Tesis evalúa un CAR19 de cuarta generación que induce la secreción constitutiva de YY. Aunque YY es una citoquina inmunomoduladora con múltiples efectos en diferentes células del TME, nos centramos en aquellos observados sobre las células CAR19-T. Brevemente, se demostró una mayor composición de células-T de memoria con el CAR19 de cuarta generación en comparación con el de segunda generación previamente desarrollado, así como una mejor expansión, secreción de IFN-[Gamma] y capacidad citotóxica de las células CAR19-T. En conclusión, nuestros resultados sugieren que la secreción constitutiva de YY por parte de células CAR19-T puede reducir la disfunción de estas células y sientan las bases para la realización de nuevos estudios con este constructo.

Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells combine the specificity of a monoclonal antibody with the signal activating machinery of a T cell, so they can recognize and kill tumor cells. Although CAR-T cells targeting CD19 antigen (CAR19-T) have been the most studied to date, new therapies against other antigens like CD30 (CAR30-T) are increasingly arising. Despite their high success in the past years, there is room for improvement in CAR-T cell efficacy, since there are still many patients who do not benefit from this therapy. For the treatment of lymphoma, only less than 50% of the patients achieve long-term disease control. This may be related to different factors, including immunosuppression, intrinsic tumor resistance or CAR-T cell dysfunction and lack of persistence. Consequently, we aimed to develop optimized CAR-T cell therapies for the treatment of refractory and relapsed classical Hodgkin lymphoma (cHL) and B-cell non-Hodgkin lymphoma (B-NHL) patients, which currently have a poor prognosis. In this regard, some types of fourth-generation CARs have the potential to modify and resist the immunosuppressive tumor microenvironment (TME). CAR30-T cell therapies for cHL are challenged by a highly immunosuppressive TME, what hinders CAR30-T cell function. In line with this, the first part of this Thesis studies the effects of a fourth-generation CAR30 based on our already developed second-generation CAR30. XX is an inhibitory ligand expressed by cHL tumor cells and immunosuppressive cells present in TME. Therefore, the new CAR30 incorporates the expression of a switch receptor combining the recognition of XX inhibitory ligand and the co-stimulatory activity of CD28 (XXR28), in order to turn this inhibitory signal into T-cell activation and enhance the antitumor activity of CAR30-T cells by partially reducing cHL-derived immunosuppression. In summary, fourth-generation CAR30-T cells were demonstrated to promote enhanced Th1-type cytokine secretion and prolonged cytotoxic capacity in vitro, compared to second and also third-generation CAR30-T cells, which combined the same co-stimulatory domains (4-1BB and CD28). Additionally, improved functional performance of fourth-generation CAR30-T cells was also demonstrated in a murine xenograft model of cHL. Importantly, the results presented in this Thesis will presumably support the development of a clinical trial with these fourth-generation CAR30 memory-enriched T cells for the treatment of refractory cHL patients in the near future. Response rates in B-NHL suggest that increasing CAR19-T cell functionality is still necessary to improve clinical outcomes. Therefore, the second part of this Thesis evaluates the efficacy of a fourth-generation CAR19 that induces the constitutive secretion of YY compared to its second-generation counterpart. Although YY is an immunomodulatory cytokine showing multiple effects on different cells present in TME, we focused on those exerted on the same or nearby CAR19-T cells. In brief, a more predominant memory-related composition of fourth-generation CAR19-T cells was demonstrated compared to the already developed second-generation CAR19-T cells, together with an improved CAR19-T cell expansion, IFN-[Gamma] secretion and cytotoxic capacity. Remarkably, our results suggest that YY constitutive secretion by CAR19-T cells may reduce CAR19-T cell dysfunction and pave the way for the performance of further novel studies with this construct.