Evaluación y caracterización de disulfiram como agente antimicrobiano de uso tópico

Abstract

Actualment, la resistència antimicrobiana es considera una pandèmia silenciosa i una de les majors amenaces per a la salut a les quals s'enfronta la humanitat. En aquest context, la situació s'agreuja per la falta de descobriment de noves molècules actives. A més, en els últims anys, hi ha un creixent interès pels trastorns infectius de la pell i mucoses, per la seva alta prevalença i morbiditat. Per la qual cosa, és urgent reactivar la recerca i el desenvolupament de noves alternatives en aquestes àrees que permetin fer front a la farmacorresistència i superar les complexes característiques intrínseques a l' aplicació de fàrmacs en aquests teixits. En aquesta Tesi Doctoral, l'objectiu és avaluar i caracteritzar l'acció antimicrobiana de disulfiram en tres formulacions d'ús tòpic per abordar el problema de la resistència antimicrobiana des de diferents perspectives. En un primer estudi, s'ha determinat l'absorció transdèrmica i l'eficàcia in vitro contra sarna i polls d'una combinació de bencil benzoat i disulfiram (Tenutex®), producte comercial d'ús geogràficament restringit que podria ser una alternativa als insecticides estàndards. Es va utilitzar pell humana dermatomitzada per avaluar l'absorció dèrmica mitjançant un mètode validat de cromatografia líquida d'alt rendiment i es van utilitzar queratinòcits HEK001 per avaluar la citotoxicitat. Només un dels actius, el bencil benzoat, va poder permear la pell, però no va mostrar citotoxicitat en cap de les concentracions provades. L'eficàcia del producte es va assajar davant Psoroptes ovis a diferents temps de contacte i enfront de ceps resistents a la malatió d'adults i ous de Pediculus humanis capitis. L'estudi contra sarna va demostrar que l'exposició durant 6 o 24 h del producte eradicava completament el paràsit i, respecte l'activitat pediculicida, va mostrar una eficàcia superior a la del tractament estàndard en polls resistents. En el següent estudi, es va avaluar el reposicionament de disulfiram com a agent antibacterià per tractar infeccions de la pell. Aquest estudi va tenir com a objectiu determinar les característiques biofarmacèutiques del fàrmac i els efectes derivats de la seva aplicació tòpica. Les proves de susceptibilitat van mostrar activitat antibacteriana contra els bacteris grampositius Staphylococcus aureus i Streptococcus pyogenes. L'absorció dèrmica no va revelar permeació en la pell de porc i la quantificació del fàrmac retingut en teixit va demostrar concentracions en l'estrat còrni i epidermis suficients per tractar les infeccions. A més, es van realitzar anàlisis de micromatrius i citotoxicitat in vitro per comprendre millor el mecanisme del fàrmac. Aquests estudis van revelar la importància de disulfiram com a quelant d'ions metàl·lics. En el tercer estudi, a més de proposar el reposicionament de disulfiram com a agent antifúngic, es va desenvolupar i optimitzar formulacions alternatives per millorar l' eficàcia dels tractaments administrats per via vaginal. En aquest cas, es van elaborar gels mucoadhesius per a l'administració local del fàrmac. Aquestes formulacions estaven compostes de polietilenglicol i carragenat per millorar les propietats mucoadhesives i prolongar el temps de residència a la cavitat vaginal. Les proves de susceptibilitat van mostrar que disulfiram té activitat contra Candida albicans, Candida parapsilosis i Candida glabrata (Nakaseomyces glabratus). Es van caracteritzar les propietats fisicoquímiques dels gels i es van estudiar els perfils d'alliberament i permeació in vitro amb cel·les de Franz. A més, es va demostrar que la quantitat de fàrmac retingut en l'epiteli vaginal de porc era suficient per tractar la infecció. Atesa la situació d' emergència de resistència als antimicrobians, els resultats obtinguts en les tres publicacions científiques posen de manifest el potencial ús de disulfiram com a agent antimicrobià, demostrant que les formulacions proposades són una alternativa interessant per al tractament en infeccions cutanis i vaginals.

Actualmente, la resistencia antimicrobiana se considera una pandemia silenciosa y una de las mayores amenazas para la salud a las que se enfrenta la humanidad. En este contexto, la situación se agrava por la falta de descubrimiento de nuevas moléculas activas. Además, en los últimos años, hay un creciente interés por los trastornos infectivos de la piel y mucosas, por su alta prevalencia y morbilidad. Por lo que, es urgente reactivar la investigación y el desarrollo de nuevas alternativas en estas áreas que permitan hacer frente a la farmacorresistencia y superar las complejas características intrínsecas a la aplicación de fármacos en estos tejidos. En la presente Tesis Doctoral, el objetivo es evaluar y caracterizar la acción antimicrobiana de disulfiram en tres formulaciones de uso tópico para abordar el problema de la resistencia antimicrobiana desde diferentes perspectivas. En un primer estudio, se ha determinado la absorción transdérmica y la eficacia in vitro contra sarna y piojos de una combinación de bencil benzoato y disulfiram (Tenutex®), producto comercial de uso geográficamente restringido que podría ser una alternativa a los insecticidas estándares. Se empleó piel humana dermatomizada para evaluar la absorción dérmica mediante un método validado de cromatografía líquida de alto rendimiento y se utilizaron queratinocitos HEK001 para evaluar la citotoxicidad. Sólo uno de los activos, el bencil benzoato, pudo permear la piel, pero no mostró citotoxicidad en ninguna de las concentraciones probadas. La eficacia del producto se ensayó frente a Psoroptes ovis a diferentes tiempos de contacto y frente a cepas resistentes a permetrina/malatión de adultos y huevos de Pediculus humanis capitis. El estudio contra sarna demostró que la exposición durante 6 o 24 h del producto erradicaba completamente el parásito y, respecto la actividad pediculicida, mostró una eficacia superior a la del tratamiento estándar en piojos resistentes. En el siguiente estudio, se evaluó el reposicionamiento de disulfiram como agente antibacteriano para tratar infecciones de la piel. Este estudio tuvo como objetivo determinar las características biofarmacéuticas del fármaco y los efectos derivados de su aplicación tópica. Las pruebas de susceptibilidad mostraron actividad antibacteriana contra las bacterias grampositivas Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes. La absorción dérmica no reveló permeación en la piel de cerdo y la cuantificación del fármaco retenido en tejido demostró concentraciones en el estrato córneo y epidermis suficientes para tratar las infecciones. Además, se realizaron análisis de micromatrices y citotoxicidad in vitro para comprender mejor el mecanismo acción del fármaco. Estos estudios revelaron la importancia de disulfiram como quelante de iones metálicos. En el tercer estudio, además de proponer el reposicionamiento de disulfiram como agente antifúngico, se desarrolló y optimizó formulaciones alternativas para mejorar la eficacia de los tratamientos administrados por vía vaginal. En este caso, se elaboraron geles mucoadhesivos para la administración local del fármaco. Dichas formulaciones estaban compuestas de polietilenglicol y carragenato para mejorar las propiedades mucoadhesivas y prolongar el tiempo de residencia en la cavidad vaginal. Las pruebas de susceptibilidad mostraron que disulfiram tiene actividad contra Candida albicans, Candida parapsilosis y Candida glabrata (Nakaseomyces glabratus). Se caracterizaron las propiedades fisicoquímicas de los geles y se estudiaron los perfiles de liberación y permeación in vitro con celdas de Franz. Además, se demostró que la cantidad de fármaco retenido en el epitelio vaginal de cerdo era suficiente para tratar la infección. Dada la situación de emergencia de resistencia a los antimicrobianos, los resultados obtenidos en las tres publicaciones científicas ponen de manifiesto el potencial uso de disulfiram como agente antimicrobiana, demostrando que las formulaciones propuestas son una alternativa interesante para el tratamiento en infecciones cutáneos y vaginales.

Currently, antimicrobial resistance is considered a silent pandemic and one of the greatest health threats facing humanity. In this context, the situation is aggravated by the lack of discovery of new active molecules. In addition, in recent years, there is a growing interest in infective disorders of the skin and mucous membranes, due to their high prevalence and morbidity. Therefore, it is urgent to reactivate research and development of new alternatives in these areas that allow us to address drug resistance and overcome the complex intrinsic characteristics to the application of drugs in these tissues. In this Doctoral Thesis, the objective is to evaluate and characterize the antimicrobial action of disulfiram in three formulations for topical use to address the problem of antimicrobial resistance from different perspectives. In a first study, the transdermal absorption and in vitro efficacy against scabies and lice of a combination of benzyl benzoate and disulfiram (Tenutex®), a commercial product of geographically restricted use that could be an alternative to standard insecticides, has been determined. Dermatomicized human skin was used to assess dermal absorption using a validated high-performance liquid chromatography method and HEK001 keratinocytes were used to evaluate cytotoxicity. Only one of the actives, benzyl benzoate, was able to permeate the skin, but it did not show cytotoxicity at any of the tested concentrations. The efficacy of the product was tested on Psoroptes ovis at different contact times and against adult permethrin/malathion resistant strains and eggs of Pediculus humanis capitis. The anti-scabies study demonstrated that exposure for 6 or 24 h of the product completely eradicated the parasite and, with respect to pediculicidal activity, it exhibited superior efficacy to that of standard treatment in resistant lice. In the following study, the repositioning of disulfiram as an antibacterial agent to treat skin infections was evaluated. This study aimed to determine the biopharmaceutical characteristics of the drug and the effects arising from its topical application. Susceptibility tests showed antibacterial activity against the Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes. Dermal absorption revealed no permeation in pig skin and the quantification of the drug retained in tissue demonstrated concentrations in the stratum corneum and epidermis, enough to treat infections. In addition, micro-array and in vitro cytotoxicity analyses were performed to better understand the mechanism of action of the drug. These studies revealed the importance of disulfiram as a of metal ion chelator. In the third study, in addition to the repositioning of disulfiram as an antifungal agent, alternative formulations were developed and optimized to improve the efficacy of vaginally administered treatments. In this case, mucoadhesive gels were developed for local administration of the drug. These formulations were composed of polyethylene glycol and carrageenan to improve mucoadhesive properties and to prolong the residence time in the vaginal cavity. Susceptibility tests showed that disulfiram has activity against Candida albicans, Candida parapsilosis and Candida glabrata (Nakaseomyces glabratus). The physicochemical properties of the gels were characterized, and the release and permeation profiles were studied in vitro with Franz cells. In addition, it was shown that the amount of drug retained in the pig vaginal epithelium was sufficient to treat the infection. Given the emergency of antimicrobial resistance, the results obtained in the three publications highlight the potential use of disulfiram as an antimicrobial agent, demonstrating that the proposed formulations are an interesting alternative for the treatment of skin and vaginal infections.