Theoretical and experimental study of the reaction mechanism of several lipoxygenases and hydrolases: governing their product pattern by mutagenesis

Abstract

Les lipoxigenases són una família d'enzims involucrats en el sistema immunitari que són capaces d'oxidar de forma estèreo i regioselectiva una família de compostos anomenada àcids grassos poliinsaturats. El producte d'aquestes reaccions bioquímiques és una sèrie de compostos biosenyalitzadors que participen en la inflamació i la resolució d'aquesta. Al llarg de la present Tesis, s'ha estudiat quatre lipoxigenases diferents, centrant l'estudi en les diferències entre enzims provinent del mateix gen en diferents espècies de mamífer, l'efecte de l'aplicació de mutacions en regions claus de l'enzim per tal de modificar-ne l'especificitat i en el mecanisme biocatalític que condueix les transformacions dels àcids grassos en molècules biosenyalitzadores. A més a més, s'ha estudiat el rol de dues proteïnes estretament relacionades amb les lipoxigenases. D'una banda, s'ha estudiat el rol de la Five-Lipoxygenase-Activating protein, clau per al correcte funcionament de a Lipoxigenasa 5, immersa en una membrana nuclear. De l'altra, s'ha estudiat el mecanisme biocatalític de la Leukotriene A4 Hydrolase, que participa en la síntesi del Leucotriè B4, compost clau en etapes d'inflamació. També s'ha dissenyat mutants de la Leukotriene A4 Hydrolase centrant-se en la modificació de la cavitat enzimàtica per a permetre la reactivitat de derivats de l'àcid docosahexaenoic, de manera que sigui possible la seva aplicació en una síntesis industrial de la Maresina-1, una de les molècules biosenyalitzadores més potents per a la resolució de la inflamació, aplicable com a tractament per a pacients de malalties inflamatòries cròniques com la COVID-19, la ELA o la EM, entre moltes altres.

Aquests estudis s'han realitzat des de dos punts de vista: l'experimental i el computacional. D'una banda, s'han expressat alguns dels enzims estudiats i, mitjançant la incubació amb àcids grassos, s'ha analitzat els productes obtinguts per tal de comprendre l'estèreo i regioselectivat dels enzims. D'altra banda, s'han aplicat mètodes de la Química Computacional com el Docking molecular, la dinàmica molecular i els càlculs QM/MM per a explorar diferents aspectes dels enzims, des de la interacció entre la proteïna i el substrat fins al mecanisme biocatalític a nivell quàntic.

Las lipoxigenasas son una familia de enzimas involucrada en el sistema inmunitario que son capaces de oxidar de forma estéreo y regioselectiva una familia de compuestos llamada ácidos grasos poliinsaturados. El producto de estas reacciones bioquímicas es una serie de compuestos bioseñalizadoras que participan en la inflamación y en su resolución. A lo largo de esta Tesis se han estudiado cuatro lipoxigenasas distintas, centrando el estudio en las diferencias entre enzimas codificadas en el mismo gen en distintas especies de mamífero, el efecto de la aplicación de mutaciones en regiones claves de la enzima con el objetivo de modificar su especificidad y en el mecanismo biocatalítico que conduce las transformaciones de los ácidos grasos en moléculas bioseñalizadoras. Además, se ha estudiado el rol de dos proteínas estrechamente relacionadas con las lipoxigenasas. Por un lado, se ha estudiado el rol de la Five-Lipoxygenase-Activating protein, clave para el correcto funcionamiento de la Lipoxigenasa 5, inmersa en una membrana nuclear. Por otro lado, se ha estudiado el mecanismo biocatalítico de la Leukotriene A4 Hydrolase, que participa en la síntesis del Leucotrieno B4, compuesto clave en etapas de inflamación. También se han diseñado mutantes de la Leukotriene A4 Hydrolase, centrándose en la modificación de la cavidad enzimática para permitir la reactividad de compuestos derivados del ácido docosahexaenoico, de manera que sea posible su aplicación en una síntesis industrial de la Maresina-1, una de las moléculas bioseñalizadoras más potentes para la resolución de la inflamación, aplicable como tratamiento para pacientes de enfermedades inflamatorias crónicas como la COVID-19, la ELA o la EM, entre muchas otras.

Estos estudios se han realizado desde dos puntos de vista: el experimental y el computacional. Por un lado, se han expresado algunas de las enzimas estudias y, mediante la incubación con ácidos grasos, se han analizado los productos obtenidos con la finalidad de entender la estéreo y regioselectividad de las enzimas. Por otro lado, se han aplicado métodos de la Química Computacional como el Docking molecular, la dinámica molecular y los cálculos QM/MM para explorar distintos aspectos de las enzimas desde la interacción entre la proteína y el sustrato hasta el mecanismo biocatalítico a nivel cuántico.

Lipoxygenases are a family of enzymes involved in the immune system, which are able to oxidise in a stereo- and regioselective way a family of compounds called polyunsaturated fatty acids. The product of these biochemical reactions is a series of biosignalling compounds involved in inflammation and its resolution. Along this Thesis, four different lipoxygenases have been studied focusing on the differences between two enzymes codified in the same gene of two distinct mammalian species, on the effect of the application of mutations in enzyme's key regions for the modification of the stereo- and regioselectivities of the enzyme, and on the biocatalytic mechanism that drives the transformations of the fatty acids into biosignalling molecules. Moreover, the role of the two proteins closely related with lipoxygenases has been studied. On the one hand, Five-Lipoxygenase-Activating protein, necessary for the proper function of the Lipoxigenase-5, has been studied in a nuclear membrane's environment. On the other hand, the biocatalytic mechanism of the Leukotriene A4 Hydrolase has been studied. This enzyme participates in the synthesis of the Leukotriene B4, a key compound in the inflammation stage. Furthermore, mutants of Leukotriene A4 Hydrolase have been designed focusing on its enzymatic cavity to allow the reactivity of derivatives of the docosahexaenoic acid in order to make it possible to be used in an industrial synthesis of Maresin-1, one of the most potent biosignalling molecules for the resolution of the inflammation, so it can be applicable as a drug for patients with chronic inflammatory diseases such as COVID-19, ALS or MS, among others.

These studies have been carried out from two different perspectives: the experimental and the computational. On the one hand, some of the studied enzymes have been expressed and incubated with fatty acids, and the resulting products have been analysed to understand the stereo- and regioselectivity of the enzymes. On the other hand, several methods from the Computational Chemistry field such as molecular Docking, molecular dynamics and QM/MM calculations have been applied to explore different aspects of the enzymes, from the protein-substrate interaction to the biocatalytic mechanism at the quantum level of theory.