Miniaturized analytical devices for the detection of biomarkers and monitoring of metabolic hereditary diseases

Abstract

Durant les últimes dècades hi ha hagut una marcada tendència cap a la miniaturització i l'automatització dels processos analítics per tal de reduir costs, energia, reactius i residus, i per permetre els anàlisis point-of-care (POC). Una estratègia es l'ús de plataformes microfluídiques que integren tots els elements necessaris per a la realització d'un anàlisis complert. Els sistemes analítics presentats en aquest treball son un bon exemple d'aquesta tendència. Consisteixen en sistemes miniaturitzats que permeten l'anàlisi POC per l'àmbit sanitari. Més concretament, aquesta tesi es centra en la determinació de biomarcadors per a diferents Errors Innats del Metabolisme (EIM). L'ió amoni, NH4+, ha estat seleccionat com a ió d'interès degut al seu marcat increment en la sang y les conseqüents afectacions neuronals, greus i irreversibles, en pacients que presenten Trastorns del Cicle de la Urea (TCU) no adequadament controlats. Actualment, el control dels nivells de NH4+ només es fa a laboratoris de centres de referència degut a la necessitat d'equipament car i complex. No obstant això, aquests casos requereixen d'una intervenció mèdica immediata, i el fet de que només puguin ser diagnosticats en certs hospitals dificulta l'accessibilitat a un ràpid tractament mèdic. Alternativament, aquest treball també es centra en una altra malaltia metabòlica, la Fenilcetonúria (PKU), que també requereix un control freqüent dels nivells de fenilalanina (Phe) en sang per a mantenir-los dins d'un rang acceptable. Tot i que un increment dels nivells de Phe en sang té greus conseqüències en el desenvolupament neuronal, els pacients no disposen de cap solució analítica per auto gestionar-se la seva pròpia malaltia i han de dependre únicament de controls periòdics en hospitals de referència. Per tant, existeix una imperiosa necessitat d'obtenir dispositius analítics fiables, ràpids i robusts per aquests dos analits, que han de ser barats i fàcils d'usar per permetre la seva instal·lació en totes les clíniques i llars que ho requereixin. En aquest treball es descriuen dos enfocs diferents per la determinació d'aquest dos biomarcadors en sang. El primer d'ells, que es centra només en la determinació del NH4+, es el desenvolupament d'un sistema analític d'alt rendiment per l'anàlisi continu de mostres de sang de volum reduït en hospitals i clíniques. Està basat en una plataforma microfluídica polimèrica que permet reduir l'ús de reactius, mostra i els costs. El segon enfoc es basa en una plataforma polimèrica d'un sòl ús i auto-calibrable per l'anàlisi de sang capil·lar en un àmbit domèstic, que sí està dissenyat per la detecció de tots dos biomarcadors. Tots dos dispositius analítics es basen en la potenciometria com a mètode de detecció i en l'ús de elèctrodes selectius d'ions d'estat sòlid (SC-ISE) per la detecció del NH4+. Per l'altra banda, la detecció de la Phe s'assoleix d'una forma indirecta mitjançant la conversió d'aquest aminoàcid en amoníac quan s'incorpora un enzim dins de la plataforma analítica.

Durante las últimas décadas, ha habido una marcada tendencia hacia la miniaturización y la automatización de los procesos analíticos para reducir costes, energía, reactivos y residuos, y para permitir los analisis point-of-care (POC). Una estrategia es el uso de plataformas microfluidicas que integran todos los elementos necesarios para la realización completa de un análisis. Los sistemas analíticos presentados en este trabajo son un buen ejemplo de esta tendencia. Consisten en sistemas miniaturizados que permiten el análisis POC para el ámbito sanitario. Más concretamente, esta tesis se centra en la determinación de biomarcadores para diferentes Errores Innatos del Metabolismo (EIM). El ion amonio, NH4+, ha sido seleccionado como ion de interés debido a su marcado incremento en sangre y sus consecuentes afectaciones neuronales, que son graves y de por vida, en pacientes que presentan Trastornos del Ciclo de la Urea (TCU) no debidamente controlados. Actualmente, el control de los niveles de NH4+ solo se hace en laboratorios de centros de referencia por la necesidad de equipamiento caro y complejo. Sin embargo, estos casos requieren intervención médica inmediata, y el hecho de que solo puedan ser diagnosticados en ciertos hospitales dificulta la accesibilidad a un rápido tratamiento médico. Alternativamente, este trabajo también se centra en otra enfermedad metabólica, la Fenilcetonuria (PKU), en la que también es clave un control frecuente de los niveles de fenilalanina (Phe) en sangre para mantenerlos dentro de los rangos aceptables. Aunque un incremento de los niveles de Phe tiene serias consecuencias sobre el desarrollo neuronal, los pacientes no disponen de ninguna solución analítica para auto-gestionar su propia enfermedad y deben dependen únicamente de controles periódicos en hospitales de referencia. Por lo tanto, existe una imperiosa necesidad de obtener dispositivos analíticos fiables, rápidos y robustos para estos dos analitos, y que deben ser baratos y fáciles de usar para facilitar su instalación y uso en todas las clínicas y hogares que así lo requieran. En este trabajo se describen dos enfoques diferentes para la determinación de estos biomarcadores en sangre. El primero de ellos, que se centra solo en la determinación del NH4+, es el desarrollo de un sistema analítico de alto rendimiento para el análisis continuo de muestras de sangre de volumen reducido en hospitales y clínicas. Está basado en una plataforma microfluídica polimérica que permite reducir el uso de reactivos, muestra y los costes. El segundo enfoque se basa en una plataforma polimérica desechable y auto-calibrable para el análisis de sangre capilar en un ámbito doméstico, que sí está diseñado para la detección de ambos biomarcadores. Ambos dispositivos analíticos se basan en la potenciometria como método de detección y en el uso de electrodos selectivos de iones de estado sólido (SC-ISE) para la detección del NH4+. Por otro lado, la detección de la Phe se consigue de forma indirecta mediante la conversión de este aminoácido en amoniaco al incorporar una enzima dentro de la plataforma analítica.

During the last few decades there has been a marked progression towards the miniaturization and automation of analytical processes in order to reduce costs, energy, reagents and waste and to allow for point-of-care (POC) analysis. An approach is the use of microfluidic platforms that integrate all the necessary elements to carry out a complete analysis. The analytical devices presented here are a good example of this trend. They consist of miniaturized systems to allow for POC analysis in healthcare. More specifically, this thesis focuses on the determination of biomarkers for different Inborn Errors of Metabolism (IEM). Ammonium ion, NH4+, has been selected as analyte of interest due to its marked increase in blood and its consequent serious and long-lasting neuronal affectations in patients presenting non-controlled Urea Cycle Disorders (UCDs). Currently, NH4+ determination is only carried out at the laboratories of reference centres as it requires expensive and complex equipment. However, this condition calls for immediate medical intervention and the fact that it can only be monitored in some hospitals hinders the accessibility to a swift medical treatment. Alternatively, this work also focuses on another metabolic disease, Phenylketonuria (PKU), which also requires a close surveillance to keep Phenylalanine (Phe) levels in blood within acceptable levels. Although an increase of Phe has serious consequences for the development of the neuronal system, currently patients lack a method of self-monitoring that can be used periodically at their own homes and they must rely only on periodical controls in reference hospitals. Therefore, there is an imperious need to procure reliable, fast and robust analytical devices for the determination of these two biomarkers, which must be cheap and easy to use in order to facilitate their implementation in all clinics and homes. Two different approaches for the determination of these biomarkers in blood samples are described in this thesis. The first one, focused only in NH4+ determination, is the development of a high throughput analytical system for the continuous analysis of low volume blood samples in an hospital setting, based on a polymeric microfluidic platform to reduce reagents and waste volumes and costs. The second one is the development of a single-use auto-calibrating polymeric analytical platform aimed for at-home analysis of capillary blood for the determination of both biomarkers. Both these analytical approaches rely on potentiometry as the method of detection, relying on the use of solid contact ion selective electrodes (SC-ISE) for the reliable determination of NH4+. On the contrary, Phe determination is achieved indirectly by the conversion of this amino acid into ammonia by the incorporation of an enzyme into the analytical platform.