DNA methylation alterations associated with genome endoreduplication and with tumor-infiltrating lymphocytes in colorectal cancer

Abstract

El càncer colorectal (CCR) és un dels càncers més prevalents a nivell mundial, afectant tant homes com dones. El CCR exhibeix una notable heterogeneïtat inter i intratumoral resultant de diferents alteracions genètiques i epigenètiques. S'han identificat quatre subtipus moleculars diferents de CCR basats en diferents patrons d'expressió gènica i alteracions genòmiques, que reflecteixen diferents processos biològics subjacents. Aquests subtipus abasten múltiples vies involucrades en el desenvolupament tumoral, invasió, metàstasi i resposta a teràpia. Aquesta tesi presenta dos estudis diferents que exploren els efectes fenotípics de les alteracions en la metilació de l'ADN al CCR. Al primer estudi es va investigar l'efecte de la desmetilació dels elements repetitius SST1 sobre l'estabilitat de la duplicació del genoma. Els resultats van revelar una associació entre la desmetilació de SST1 i l'endoreduplicació espontània del genoma, cosa que condueix a la tetraploïdització. L'avaluació de tumors primaris va demostrar que la desmetilació de SST1 era més prevalent en tumors amb nivells baixos de metilació en elements LINE-1 i, a més, s'associava amb la inactivació de la via de TP53. El perfil epigenòmic de tumors primaris de CCR amb i sense una forta desmetilació de seqüències SST1 utilitzant matrius de metilació EPIC d'Illumina, va revelar que la hipometilació de SST1 estava associada amb la desmetilació de regions peritelomèriques, cosa que possiblement explica la seva associació amb la fallada mitòtica i l'endoreduplicació genòmica. El segon estudi va explorar la influència de les alteracions epigenètiques en l'abundància dels limfòcits infiltrants de tumors (TIL) en CCRs primaris, amb un enfoc particular en les alteracions que afecten remodeladors de la matriu extracel·lular, específicament les famílies de gens MMP, ADAM i ADAMTS. Aquest estudi va demostrar que els gens ADAMTS es trobaven hipermetilats amb més freqüència en CCRs amb estabilitat de microsatèl·lits (MSS) amb alts nivells de TIL. Aquesta observació va suggerir que les metalopeptidases de la matriu extracel·lular podrien ser dianes terapèutiques per millorar la immunogenicitat tumoral i les respostes a les teràpies d'inhibició dels punts de control immunològic. Tots dos estudis estaven interrelacionats ja que tots dos es van completar sobre una col·lecció de mostres comunes de CCR que van ser analitzades per a mutacions, TIL i alteracions en la metilació de l'ADN utilitzant una varietat de tècniques de biologia molecular i cel·lular. A més, el perfil epigenòmic de 82 CCRs primaris utilitzant matrius de metilació EPIC d'Illumina ha facilitat l'exploració de correlacions entre mutacions, alteracions a la metilació de l'ADN, infiltració limfocítica tumoral i perfils epigenòmics.

El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más prevalentes a nivel mundial, afectando tanto a hombres como a mujeres. El CCR exhibe una notable heterogeneidad inter e intratumoral resultante de diferentes alteraciones genéticas y epigenéticas. Se han identificado cuatro subtipos moleculares distintos de CCR basados en distintos patrones de expresión génica y alteraciones genómicas, que reflejan diferentes procesos biológicos subyacentes. Estos subtipos abarcan múltiples vías involucradas en el desarrollo tumoral, invasión, metástasis y respuesta a terapia. Esta tesis presenta dos estudios distintos que exploran los efectos fenotípicos de las alteraciones en la metilación del ADN en el CCR. En el primer estudio se investigó el efecto de la desmetilación de los elementos repetitivos SST1 sobre la estabilidad de la duplicación del genoma. Los resultados revelaron una asociación entre la desmetilación de SST1 y la endoreduplicación espontánea del genoma, lo que conduce a la tetraploidización. La evaluación de tumores primarios demostró que la desmetilación de SST1 era más prevalente en tumores con niveles bajos de metilación en elementos LINE-1 y, además, se asociaba con la inactivación de la vía de TP53. El perfil epigenómico de tumores primarios de CCR con y sin una fuerte desmetilación de secuencias SST1 utilizando matrices de metilación EPIC de Illumina, reveló que la hipometilación de SST1 estaba asociada con la desmetilación de regiones periteloméricas, lo que posiblemente explica su asociación con el fallo mitótico y la endoreduplicación genómica. El segundo estudio exploró la influencia de las alteraciones epigenéticas en la abundancia de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en CCRs primarios, con un enfoque particular en las alteraciones que afectan a remodeladores de la matriz extracelular, específicamente a las familias de genes MMP, ADAM y ADAMTS. Este estudio demostró que los genes ADAMTS se encontraban hipermetilados con mayor frecuencia en CCRs con estabilidad de microsatélites (MSS) con altos niveles de TIL. Esta observación sugirió que las metalopeptidasas de la matriz extracelular podrían ser dianas terapéuticas para mejorar la inmunogenicidad tumoral y las respuestas a las terapias de inhibición de los puntos de control inmunológico. Ambos estudios estaban interrelacionados ya que ambos se completaron sobre una colección de muestras comunes de CCR que fueron analizadas para mutaciones, TIL y alteraciones en la metilación del ADN utilizando una variedad de técnicas de biología molecular y celular. Además, el perfil epigenómico de 82 CCRs primarios utilizando matrices de metilación EPIC de Illumina ha facilitado la exploración de correlaciones entre mutaciones, alteraciones en la metilación del ADN, infiltración linfocítica tumoral y perfiles epigenómicos.

Colorectal cancer (CRC) is one of the most prevalent cancers worldwide, affecting both men and women. CRC exhibits remarkable inter- and intra-tumoral heterogeneity resulting from diverse genetic and epigenetic alterations. Four distinct molecular subtypes of CRC have been identified based on distinct gene expression patterns and genomic alterations, reflecting different underlying biological processes. These subtypes encompass multiple pathways involved in tumor growth, invasion, metastasis, and response to therapy. This thesis presents two distinct studies exploring the phenotypic effects of DNA methylation alterations in CRC. The first study investigated the effect of demethylation of SST1 repetitive DNA elements on genome duplication stability. The results unveiled an association between SST1 demethylation and spontaneous genome endoreduplication, leading to tetraploidization. Examination of primary tumors demonstrated that SST1 demethylation was prevalent in tumors with low levels of methylation in LINE-1 elements and was associated with the inactivation of the TP53 pathway. Epigenomic profiling of CRC primary tumors with and without strong SST1 demethylation using EPIC HumanMethylation arrays, revealed that SST1 hypomethylation was associated with demethylation of peritelomeric regions, putatively explaining its link with mitotic failure and genomic endoreduplication. The second study explored the influence of epigenetic alterations on the abundance of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in primary CRCs, with a particular focus on alterations affecting extracellular matrix remodelers, specifically MMP, ADAM, and ADAMTS gene families. This study demonstrated that ADAMTS genes were more frequently hypermethylated in microsatellite stable (MSS) CRCs with high TIL levels. This observation suggested that extracellular matrix metallopeptidases could be therapeutic targets to enhance tumor immunogenicity and improve responses to immune checkpoint inhibition therapies. Both studies were interrelated through the use of common CRC samples analyzed for mutations, tumor-infiltrating lymphocytes, and DNA methylation alterations using a variety of molecular and cellular biology techniques. Additionally, epigenomic profiling of 82 primary CRCs using Illumina EPIC methylation arrays has facilitated the exploration of correlations between mutations, DNA methylation alterations, tumor lymphocytic infiltration, and epigenomic profiles.