Expansion of a Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor preclinical platform and its application in a high-throughput screening strategy to identify novel drug treatments

Abstract

[eng] Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are aggressive soft-tissue sarcomas. They usually appear in the clinical context of Neurofibromatosis type 1 (NF1), however, they also occur at a low frequency in the general population. There is a medical need to develop new therapies to treat MPNSTs as they are the leading cause of death in NF1 patients, and the five-year survival rate is low. Additionally, the intrinsic heterogeneity of MPNSTs complicates their histological classification, particularly in sporadic cases. For several years, our group has been collecting patient MPNSTs to develop a preclinical platform of cell lines and patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) mouse models to study MPNST biology, as well as to use them to conduct preclinical trials and personalized medicine strategies. Through using this platform, this PhD thesis centers on two main objectives: the identification of new synergistic drug combinations to treat MPNSTs from a high-throughput screening (HTS) of a large library of almost 2,000 drugs and the expansion of the platform by comprehensively characterizing six primary tumors diagnosed as MPNSTs and their derived PDOX and cell line models. HTS identified a total of 113 synergistic pairwise drug combinations, from which we selected 21 according to two synergy models (Bliss Independence and Highest Single Agent) and their targeted pathways. We tested these combinations to replicate the observed synergy in vitro using several tumor-derived cell lines, some of them derived by our group. The combination of MK-1775 (a WEE1 inhibitor) with Doxorubicin (a DNA Topoisomerase II inhibitor) is the only one presenting synergy in most cell lines, especially in those with gene TP53 mutated, significantly reducing the tumor growth rate in PDOX models. Regarding the second objective, the three cell models and six PDOXs generated from the six primary tumors clinically diagnosed as MPNSTs faithfully recapitulate the patients’ main genomic and histological features. Notably, we have generated three pairs of in vitro-in vivo models derived from the same primary tumors for the preclinical platform. The study of the six primary tumors was performed at different levels: 1) genetically, by analyzing the mutational status of the most recurrently mutated tumor suppressor genes in MPNSTs (NF1, CDKN2A, and SUZ12/EED from PRC2), and the mutational burden and signatures; 2) epigenetically, by analyzing the methylome profile of the three cell lines for molecular tumor classification; and 3) histologically, by analyzing the expression of markers clinically relevant for MPNST (SOX10, S100B, H3K27me3). The results illuminated the clinical reality of MPNSTs, finding that three of

the tumors (all sporadic cases) presented features incompatible with their initial clinical classification as MPNSTs and were thus reclassified as distinct tumor entities. In conclusion, our preclinical platform is a bona fide tool for the study of MPNSTs since it is representative of the clinical diversity of tumors diagnosed as MPNSTs, as well as being an excellent tool to test and identify novel therapeutic approaches.

[spa] Los tumores malignos de la vaina del nervio periférico (Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors, MPNSTs) son sarcomas de tejidos blandos agresivos. Suelen aparecer en el contexto clínico de la Neurofibromatosis tipo 1 (NF1), aunque también se dan en baja frecuencia en la población general. Existe una elevada urgencia médica de desarrollar nuevas terapias para tratar los MPNSTs, ya que son la principal causa de muerte en pacientes con NF1, y la tasa de supervivencia a cinco años es pobre. Además, la heterogeneidad intrínseca de los MPNSTs complica su clasificación histológica, especialmente en los casos esporádicos. Durante varios años, nuestro grupo ha estado reuniendo MPNSTs de pacientes para desarrollar una plataforma preclínica de líneas celulares y modelos murinos de xenoinjerto ortotópico derivados de paciente (Patient-derived orthotopic xenograft, PDOX) para estudiar la biología de los MPNST, así como para llevar a cabo ensayos preclínicos y estrategias de medicina personalizada. Usando esta plataforma, la tesis doctoral se centra en dos objetivos principales: la identificación de nuevas combinaciones sinérgicas de fármacos para tratar los MPNSTs a partir de un cribado de alto rendimiento (High-throughput screening, HTS) de una extensa librería de casi 2.000 fármacos y la ampliación de la plataforma de MPNSTs mediante la caracterización histológica y molecular de seis tumores primarios diagnosticados como MPNSTs y las líneas celulares y PDOX generados a partir de éstos. El HTS identificó un total de 113 combinaciones sinérgicas de fármacos, de las que seleccionamos 21 según dos modelos de sinergia (Bliss Independence y Highest Single Agent) y sus dianas moleculares. Estas combinaciones fueron testadas por nuestro grupo para replicar la sinergia observada en el HTS, utilizando varias líneas celulares derivadas de tumores, algunas de ellas derivadas por nuestro grupo. La combinación de MK-1775 (un inhibidor de WEE1) con Doxorrubicina (un inhibidor de la Topoisomerasa II del ADN) es la única que presenta sinergia en la mayoría de las líneas celulares, especialmente en aquellas con el gen TP53 mutado, y reduce significativamente la tasa de crecimiento tumoral en modelos PDOX. En cuanto al segundo objetivo, los tres modelos celulares y los seis PDOX generados a partir de los seis tumores primarios diagnosticados clínicamente como MPNSTs recapitulan fielmente las principales características genómicas e histológicas de los pacientes. En particular, hemos generado tres parejas de modelos in vitro-in vivo derivados de los mismos tumores primarios. El estudio de los seis tumores primarios se realizó a diferentes niveles: 1) genético, mediante el análisis del estado mutacional de los genes supresores tumorales más recurrentemente inactivados en los MPNST (NF1, CDKN2A y SUZ12/EED del PRC2), y de la carga y las firmas

mutacionales; 2) epigenético, mediante el análisis del perfil del metiloma de las tres líneas celulares para la clasificación molecular de los tumores; y 3) histológicamente, analizando la expresión de marcadores clínicamente relevantes para los MPNSTs (SOX10, S100B, H3K27me3). Los resultados arrojaron luz sobre la realidad clínica de los MPNSTs, descubriéndose que tres de los tumores (todos ellos casos esporádicos) presentaban características incompatibles con su clasificación clínica como MPNST, por lo que fueron reclasificados como otras entidades tumorales. En conclusión, nuestra plataforma preclínica es una útil herramienta para el estudio de los MPNSTs ya que es representativa de la diversidad clínica de los tumores diagnosticados como MPNST, además de ser una excelente herramienta para probar e identificar nuevas aproximaciones terapéuticas.