Efecto antitumoral de las fenotiazinas antipsicóticas en Glioblastoma: potencial coadyuvante con temozolamida

Abstract

[cat] ntroducció: Els gliomes son els tumors primaris cerebrals més comuns del CNS amb una incidència ajustada per edat de 4.67 a 5.73 persones per cada 100000 habitants. Segons el CNS5, el glioblastoma (GBM) constitueix la forma més agressiva i letal dels tumors glials amb una taxa de supervivència mitjana de 15 mesos. Els pacients reben un tractament multimodal que consisteix en una màxima resecció quirúrgica seguida de radioteràpia i quimioteràpia concomitant i adjuvant amb temozolomida (TMZ). En aquesta situació, resulta imperatiu desenvolupar una estratègia terapèutica específica i efectiva per combatre el GBM. En aquest context, actualment s’està avaluant el reposicionament dels fàrmacs antipsicòtics com a possible estratègia terapèutica per a combatre el GBM. En la present tesi doctoral s’ha caracteritzat l'efecte antitumoral de certs fàrmacs de la família de les fenotiazines antipsicòtiques i, s’ha avaluat el potencial terapèutic de la combinació d’aquests fàrmacs amb TMZ, en diversos models de GBM. Contingut de la investigació: En primer lloc, s’ha determinat que les PTZs antipsicòtiques trifluoperazina (TFP), tioridazina (TRD), clorpromazina (CPZ) i perfenazina (PPZ) exhibeixen un marcat efecte citotòxic sobre les cèl·lules de GBM. Concretament, s’ha descobert que TRD i CPZ promouen un arrest a G2/M del cicle cel·lular, previ a l’activació de la mort cel·lular per apoptosi. La caracterització específica de l’efecte cel·lular de CPZ ha revelat que la fenotiazina antipsicòtica indueix un dany significatiu a l’ADN de les cèl·lules de GBM, tot i que no és suficient per activar el punt de control de la fase G2. Els nostres resultats confirmen que és a la fase M on CPZ exerceix la seva acció, impedint la correcta distribució del fus mitòtic a la cèl·lula, i generant en conseqüència, una morfologia monoastral caracteritzada per una distribució del centrosoma en posició central o lateral. L’anàlisi in silico evidencia que una de les dianes moleculars de CPZ és la quinesina mitòtica Eg5, la inhibició de la qual seria responsable del fenotip mitòtic observat En segon lloc, es va estudiar la possible relació entre les fenotiazines antipsicòtiques i la família de factors de transcripció FOXO a GBM. Aquest estudi confirma que les fenotiazines tenen diferents mecanismes d'acció. Es va observar que els models de GBM silenciats per a l’expressió de FOXO1 i FOXO3 responen de manera similar al fàrmac CPZ. Tot i així, l’efecte de TFP es veu reduït en silenciar aquests gens. Aquest fet suggereix que la presència de FOXO1 i FOXO3 és essencial per a l’acció terapèutica de TFP, però no per a la de CPZ. En tercer lloc, s’ha caracteritzat l’efecte de la combinació farmacològica de TMZ amb TRD o CPZ, a llargs temps d’exposició, en cèl·lules de GBM. TMZ i les PTZs estudiades exhibeixen un clar sinergisme a la majoria de les ràtios de combinació estudiades, fet que sustenta la futura aplicació clínica. Finalment, s’ha realitzat un estudi pilot in vivo per avaluar el potencial terapèutic de la combinació farmacològica de TMZ i CPZ. L’únic grup experimental que presenta una supervivència mitjana superior al grup control és el grup que va rebre la pauta de tractament de TMZ i CPZ. Un estudi del perfil mitòtic a les mostres obtingudes d’aquest estudi confirma que CPZ exerceix el seu efecte antimitòtic en models animals i, que aquest efecte és superior en combinació amb TMZ. Conclusió: Totes les evidències recollides en la present tesi doctoral donen suport a la viabilitat de l’aplicació de CPZ a la pràctica clínica, específicament com a tractament adjuvant amb TMZ per a pacients amb GBM.

[spa] Introducción: Los gliomas son los tumores primarios cerebrales más comunes del CNS con una incidencia ajustada por edad de 4.67 a 5.73 personas por cada 100000 habitantes. Según el CNS5, el glioblastoma (GBM) constituye la forma más agresiva y letal de los tumores gliales, con una tasa de supervivencia media de 15 meses. Los pacientes reciben un tratamiento multimodal que consiste en una máxima resección quirúrgica seguida de radioterapia y quimioterapia concomitante y adyuvante con temozolomida (TMZ). En la presente situación, resulta imperativo desarrollar una estrategia terapéutica específica y efectiva para combatir el GBM. En este contexto, actualmente se está evaluando el reposicionamiento de los fármacos antipsicóticos como posible estrategia terapéutica para combatir el GBM. En la presente tesis doctoral se ha caracterizado el efecto antitumoral de ciertos fármacos de la familia de las fenotiazinas antipsicóticas (PTZs) y, se ha evaluado el potencial terapéutico de la combinación de estos fármacos con TMZ, en diversos modelos de GBM. Contenido de la Investigación: En primer lugar, se ha determinado que las fenotiazinas antipsicóticas trifluoperazina (TFP), tioridazina (TRD), clorpromazina (CPZ) y perfenazina (PPZ) exhiben un marcado efecto citotóxico sobre las células de GBM. Concretamente, TRD y CPZ promueven un arresto en G2/M del ciclo celular, previo a la activación de la muerte celular por apoptosis. La caracterización específica del efecto celular de CPZ ha revelado que la fenotiazina antipsicótica induce un daño significativo en el ADN de las células de GBM, a pesar de no ser suficiente para activar el punto de control de la fase G2. Nuestros resultados confirman que es en la fase M dónde CPZ ejerce su acción, impidiendo la correcta distribución del huso mitótico en la célula, y generando en consecuencia una morfología monoastral caracterizada por una distribución del centrosoma en posición central o lateral. El análisis in silico evidencia que una de las dianas moleculares de CPZ es la quinesina mitótica Eg5, cuya inhibición podría ser responsable del fenotipo mitótico observado. En segundo lugar, se estudió la posible relación entre las fenotiazinas antipsicóticas y la familia de factores de transcripción FOXO en GBM. Este estudio confirma que las PTZs poseen mecanismos de acción diferentes. Se observó que los modelos de GBM silenciados para la expresión de FOXO1 y FOXO3 responden de manera similar frente el fármaco CPZ. No obstante, el efecto de TFP se ve reducido al silenciar dichos genes. Este hecho sugiere que la presencia de FOXO1 y FOXO3 es esencial para la acción terapéutica de TFP, pero no para la de CPZ. En tercer lugar, se ha caracterizado el efecto de la combinación farmacológica de TMZ con TRD o CPZ, a largos tiempos de exposición en células de GBM. TMZ y las PTZs estudiadas exhiben un claro sinergismo en la mayoría de las ratios de combinación estudiadas, hecho que sustenta la futura aplicación clínica. Finalmente, se ha realizado un estudio piloto in vivo para evaluar el potencial terapéutico de la combinación farmacológica de TMZ y CPZ. El único grupo experimental en presentar una supervivencia media superior al grupo control es el grupo que recibió la pauta de tratamiento de TMZ y CPZ. Un estudio del perfil mitótico en las muestras obtenidas de este estudio confirma que CPZ ejerce su efecto anti-mitótico en modelos animales y, que este es mayor en combinación con TMZ. Conclusión: Todas las evidencias recogidas en la presente tesis doctoral respaldan la viabilidad de la aplicación de CPZ en la práctica clínica, específicamente como tratamiento coadyuvante con TMZ para pacientes con GBM.

[eng] Introduction: Gliomas are the most common primary brain tumors of the CNS, with an age-adjusted incidence from 4.67 to 5.73 per 100,000 people. According to CNS5, glioblastoma (GBM) represents the most aggressive and lethal form among glial tumors, with a median survival rate of 15 months. Patients undergo a multimodal treatment approach, including maximal surgical resection followed by radiotherapy and concurrent and adjuvant chemotherapy with temozolomide (TMZ). In this context, it is imperative to develop a specific and effective therapeutic strategy against GBM. In this context, the repositioning of antipsychotic drugs for GBM treatment has been evaluated during the last decades. This doctoral thesis characterizes the antitumor effect of specific drugs belonging to the antipsychotic phenothiazine family and assesses the therapeutic potential of their combination with TMZ across diverse GBM models. Research content: Firstly, it has been determined that the PTZs trifluoperazine (TFP), thioridazine (TRD), chlorpromazine (CPZ), and perphenazine (PPZ) exhibit a pronounced cytotoxic effect on GBM cells. Specifically, it has been found that TRD and CPZ induce a G2/M cell cycle arrest prior to the activation of apoptosis-mediated cell death. The specific characterization of the cellular effect of CPZ has revealed that the antipsychotic phenothiazine induces significant DNA damage in GBM cells. Nevertheless, this effect does not meet the threshold to activate the G2 phase checkpoint, enabling cells to enter into the cell division phase. Our results confirm that it is in the M phase where CPZ exerts its action, preventing the proper distribution of the mitotic spindle in the cell. Distinctly, It generates a monoastral morphology characterized by a centrosome distribution in a central or lateral position. In silico analysis reveals that CPZ targets the mitotic kinesin Eg5, whose inhibition is responsible for the observed mitotic phenotype. Secondly, the potential association between PTZs and the FOXO transcription factor family in GBM, is evaluated. Our study confirms that PTZs have different mechanisms of action. It is observed that FOXO1 and FOXO3 DKD GBM models respond similarly to CPZ. However, the effect of TFP is diminished when these genes are silenced. These results suggest that the presence of FOXO1 and FOXO3 is essential for the therapeutic action of TFP but not for CPZ. Thirdly, the combination effect of TMZ with TRD or CPZ has been characterized over extended exposure times in GBM cells. TMZ and the studied PTZs demonstrate a clear synergism in most of the studied combination ratios, providing robust support for future clinical consideration. Finally, a pilot in vivo study has been conducted to assess the therapeutic potential of the pharmacological combination of TMZ and CPZ. The group which has received the TMZ and CPZ treatment regimen is the only one showing a higher median survival than the control group. An analysis of the mitotic profile of the samples derived from this study, confirms that CPZ exerts its anti-mitotic effect in animal models. Furthermore, the observed effect is notably enhanced when CPZ is administered in combination with TMZ. Conclusion: All the evidence gathered in this doctoral thesis supports the feasibility of applying CPZ in clinical practice, specifically as an adjuvant treatment with TMZ for patients with GBM.