Synthrocytes: Synthetic erythrocytes to substitute animal red blood cells in hemagglutination assays for global influenza surveillance

Abstract

Els virus influenza són responsables de les epidèmies estacionals de grip i cada any causen una morbiditat i mortalitat significatives, així com un elevat cost econòmic. La severitat de la epidèmia és proporcional al grau de protecció immunològica de la població, que a la vegada es relaciona amb l'elevada taxa de mutació de les proteïnes de l'embolcall víric. El principal mitjà de prevenció és la vacunació, que ha de reformular-se anualment degut a la deriva antigènica del virus. Per això és necessari establir una xarxa de vigilància global que agrupi les dades genètiques i antigèniques necessàries per determinar la composició de la vacuna anualment. Aquesta tasca es realitza gràcies a una xarxa de laboratoris distribuïts globalment que coordina la Organització Mundial de la Salut (OMS).

Els assajos d'inhibició de la hemoaglutinació (AIH) són un dels mètodes recomanats per la OMS per la caracterització antigènica dels virus influenza circulants, així com per la valoració d'anticossos neutralitzants (Ac) específics contra ells, totes dues dades necessàries per la reformulació anual de la vacuna. Els AIH es basen en la capacitat dels virus influenza per unir-se als glòbuls vermells produint la seva aglutinació i canviant el patró de sedimentació, un comportament que s'inhibeix en presència d'Ac específics anti-influenza. Els AIH són una tècnica simple i econòmica, però requereixen l'ús d'eritròcits frescos. Aquest reactiu biològic és variable, poc estable i difícil d'obtenir en grans quantitats per a la seva distribució global. Això fa que hagi de ser obtingut de forma independent per cada laboratori, el que introdueix molta variabilitat intra i inter-laboratori als resultats obtinguts.

L'objectiu principal d'aquesta tesi és el desenvolupament d'un reactiu sintètic que pugui substituir als eritròcits animals en AIH. Aquest reactiu, anomenat "sintròcit", és capaç de imitar la sedimentació diferencial característica dels eritròcits animals en absència o presència d'agents aglutinants, en <25 min. Al final d'aquest treball, els sintròcits produïts són capaços d'unir els 4 tipus de virus estacionals (A(H1N1)pdm09, A(H3N2), B/Yamagata and B/Victoria), produint canvis en la sedimentació similars als que produeixen els eritròcits animals en 30-60 min, sense pràcticament modificar el protocol ni la manipulació comparada amb els AIH clàssics. A més, els sintròcits són reproduïbles i més estables que el seu equivalent animal, poden ser liofilitzats pel seu emmagatzematge prolongat i es poden produir industrialment.

Aquesta feina ha sigut el primer pas per a la creació d'una nova línia d'investigació que ha continuat més enllà d'aquesta tesi amb la contribució d'altres membres de l'equip. Els resultats resumits aquí, així com aquells que s'han obtingut més tard i els que s'obtindran, ens apropen més a aconseguir l'estandardització global dels AIH sense necessitat de modificar la formació ni la metodologia actual, facilitant així l'avaluació dels resultats entre laboratoris.

Los virus Influenza son responsables de las epidemias estacionales de gripe que cada año causan una morbilidad y mortalidad significativas, así como con un elevado coste económico mundial. La severidad de la epidemia es proporcional al grado de protección inmunológica de la población, que a su vez se relaciona con la elevada tasa de mutación de las proteínas de la envoltura vírica. La principal medida de prevención es la vacunación, que debe reformularse anualmente debido a la deriva antigénica del virus. Por ello, es necesario establecer una red de vigilancia global que agrupe los datos genéticos y antigénicos necesarios para determinar la composición de la vacuna cada año. Esta tarea se realiza gracias a una red de laboratorios distribuidos mundialmente que coordina la Organización Mundial de la Salud (OMS).

Los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (EIH) son uno de los métodos recomendados por la OMS para la caracterización antigénica de los virus influenza circulantes, así como para la valoración de anticuerpos (Ac) neutralizantes específicos contra ellos, ambos datos necesarios para la reformulación anual de la vacuna. Los EIH se basan en la capacidad de los virus influenza para unirse a los glóbulos rojos produciendo su aglutinación y cambiando su patrón de sedimentación, un comportamiento que se evita en presencia de Ac específicos anti-influenza. Los EIH son una técnica simple y económica, pero con el inconveniente de requerir el uso de eritrocitos frescos. Este reactivo biológico es variable, poco estable y difícil de obtener en grandes cantidades para su distribución global. Esto hace que deba ser adquirido de forma independiente por cada laboratorio, lo que introduce variabilidad intra e inter-laboratorio en los resultados obtenidos.

El objetivo principal de esta tesis es el desarrollo de un reactivo sintético que pueda substituir a los eritrocitos animales en EIH. Este reactivo, llamado "sintrocito", es capaz de imitar la sedimentación diferencial característica de los eritrocitos animales en ausencia o en presencia de agentes aglutinantes en menos de 25 min. Al término de este trabajo, los sintrocitos producidos son capaces de unir los 4 tipos de virus influenza estacionales (A(H1N1)pdm09, A(H3N2), B/Yamagata and B/Victoria), produciendo cambios en la sedimentación similares a los que producen los eritrocitos en 30-60 min, sin apenas modificar el protocolo ni la manipulación comparado con los EIH clásicos. Además, los sintrocitos son reproducibles y más estables que su equivalente animal, pueden ser liofilizados para su almacenamiento prolongado y pueden ser producidos industrialmente.

Este trabajo fue el primer paso para la creación de una nueva línea de investigación que ha continuado más allá de esta tesis con la contribución de otros miembros del equipo. Los resultados resumidos aquí, así como aquellos que han seguido y seguirán, nos acercan más a conseguir la estandarización global de los EIH sin necesidad de modificar la formación ni la metodología actual, facilitando la evaluación de resultados entre laboratorios.

Influenza viruses cause annually seasonal flu epidemics with an important morbidity and mortality, as well as a high economical cost worldwide. The severity of the annual influenza epidemic is proportional to the degree of immune protection of the population, which is related to the high change rate of the viral envelope of these viruses. Since annual vaccination is the main prevention measure, the high antigenic drift obliges to the annual reformulation of the vaccine composition. Accordingly, global virological surveillance of circulating influenza viruses is required in order to collect genetic and antigenic information necessary to determine the vaccine composition yearly, a task that is coordinated globally by the World Health Organization (WHO) and to which laboratories from all over the world contribute.

The hemagglutination inhibition assay (HAI) is one of the methods recommended by the WHO for the antigenic characterization of circulating influenza viruses and for the titration of specific neutralizing antibodies (Ab) against them, two tasks that are crucial for the annual recommendation of the vaccine composition. HAI is based on the fact that influenza binds to red-blood cells producing their agglutination and changing their sedimentation pattern, a behaviour that is prevented in the presence of specific anti-influenza Ab. HAI is a relatively simple and economical assay, but it has to be carried out with fresh erythrocytes. This is a biological reagent that is variable, unstable and difficult to obtain in large quantities for worldwide distribution, and that is acquired independently by each laboratory, which introduces lots of intra- and inter-laboratory variability in the results produced.

The main objective of this PhD Thesis was the development of a synthetic reagent that could substitute animal erythrocytes in the HAI assays. As it will be shown, a reagent called "synthrocyte" has been developed, which mimics the differential sedimentation displayed by animal RBCs in the absence and in the presence of agglutinating agents in <25 min. By the end of this Thesis work, synthrocytes could bind the 4 influenza seasonal subtypes (A(H1N1)pdm09, A(H3N2), B/Yamagata and B/Victoria), producing changes in sedimentation that resembled those generated by erythrocytes in 30-60 min, and entailing a protocol and level of handling similar to those in classical HAI assays. Moreover, synthrocytes were reproducible and more stable than their animal counterparts, could be lyophilized for long-term storage, and were mass-producible.

This work laid the first stone for the creation of a new research line that has continued beyond this Thesis with the contribution of other Team Members. We envisage that the results summarized here, and those that followed and will follow, will pave the way to achieve the worldwide standardization of HAI tests with minimal equipment or training requirements and facilitate inter-laboratory result evaluation.