Base genética de la coloración de la pulpa de melón

Abstract

Al fruit de meló, la coloració de la polpa pot ser blanca, verda o taronja, depenent de l'acumulació de clorofil·les i/o carotenoides. Aquest caràcter està determinat per dos gens: Green flesh (Gf) i White flesh (Wf), essent Gf epistàtic sobre Wf. Mentre que Gf és el responsable de la coloració taronja de la polpa, Wf és el principal determinant de la coloració blanca i verda, sent la blanca dominant sobre la verda. El gen Gf, localitzat al cromosoma 9, és MELO3C005449, també conegut com ORANGE (CmOr). La presència de l'al·lel dominant de Gf (CmOrHis) comporta l'acumulació de [Beta]-carotè i, per tant, la coloració ataronjada de la polpa del fruit. La identitat del gen Wf encara no es coneix, encara que s'han proposat diversos candidats. Prèviament al nostre estudi, es van creuar les varietats de meló de polpa blanca Piel de Sapo (PS, gf gf / Wf Wf) i polpa taronja Vedrantais (VED, Gf Gf / wf wf) i es va generar una col·lecció de línies consanguínies recombinants (RILs ) que van permetre identificar un QTL al cromosoma 8, denominat LUMQU8.1, associat amb la coloració blanca i verda del fruit. Mitjançant diferents abordatges com el mapeig fi del QTL LUMQU8.1 i experiments d'expressió transitòria a Nicotiana benthamiana de gens candidats presents a l'interval vam aconseguir identificar el gen corresponent a Wf. La generació i caracterització de les línies transgèniques d'Arabidopsis thaliana sobreexpressores dels al·lels de PS i VED per a Wf va permetre determinar que la variant de PS per a Wf està implicada en la repressió de la síntesi de clorofil·les i el desenvolupament de cloroplasts, presentant aquestes línies una desetiolació més lenta i un gran impacte en l'expressió de gens relacionats amb la fotosíntesi respecte a les línies sobreexpressores de l'al·lel de VED i el control sense transformar (Col-0). Mitjançant un assaig de marcatge per proximitat (TurboID) amb les variants de PS i VED per a Wf a N. benthamiana vam trobar que Wf interacciona amb una xaperona citosòlica implicada en el transport i acoblament de proteïnes a la membrana externa del cloroplast. A partir d'aquesta informació hem elaborat un model de regulació molecular de la coloració de la polpa del fruit del meló. Els fruits de meló són blancs durant els primers estadis de desenvolupament i presenten plastos amb estructures membranoses poc diferenciades. Als melons de polpa taronja, la variant CmOrHis indueix la síntesi de carotenoides i la diferenciació de cromoplasts. Als fruits que no tenen la variant CmOrHis, els fruits madurs seran blancs o verds depenent de la variant de Wf, l'expressió dels quals s'indueix amb els primers canvis de color associats a la diferenciació d'amiloplasts (blancs) o cloroplasts (verds). Als melons blancs, la variant activa PS-Wf actua reprimint l'acció de gens implicats en la síntesi de clorofil·les i el desenvolupament de cloroplasts. En els fruits de varietats verdes, la variant VED-Wf en no ser funcional és incapaç de reprimir aquests gens, els quals fan la seva funció i indueixen al desenvolupament de cloroplasts.

En el fruto de melón, la coloración de la pulpa puede ser blanca, verde o naranja, dependiendo de la acumulación de clorofilas y/o carotenoides. Este carácter está determinado por dos genes: Green flesh (Gf) y White flesh (Wf), siendo Gf epistático sobre Wf. Mientras que Gf es el responsable de la coloración naranja de la pulpa, Wf es el principal determinante de la coloración blanca y verde, siendo la blanca dominante sobre la verde. El gen Gf, localizado en el cromosoma 9, es MELO3C005449, también conocido como ORANGE (CmOr). La presencia del alelo dominante de Gf (CmOrHis) conlleva la acumulación de [Beta]-caroteno y, por tanto, la coloración anaranjada de la pulpa del fruto. La identidad del gen Wf no se conoce aún, aunque se han propuesto varios candidatos. Previamente a nuestro estudio, se cruzaron las variedades de melón de pulpa blanca Piel de Sapo (PS, gf gf / Wf Wf) y pulpa naranja Vedrantais (VED, Gf Gf / wf wf) y se generó una colección de líneas consanguíneas recombinantes (RILs) que permitieron identificar un QTL en el cromosoma 8, denominado LUMQU8.1, asociado con la coloración blanca y verde del fruto. Mediante distintos abordajes como el mapeo fino del QTL LUMQU8.1 y experimentos de expresión transitoria en Nicotiana benthamiana de genes candidatos presentes en el intervalo conseguimos identificar el gen correspondiente a Wf. La generación y caracterización de las líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana sobreexpresoras de los alelos de PS y VED para Wf permitió determinar que la variante de PS para Wf está implicada en la represión de la síntesis de clorofilas y el desarrollo de cloroplastos, presentando estas líneas una desetiolación más lenta y un gran impacto en la expresión de genes relacionados con la fotosíntesis respecto a las líneas sobreexpresoras del alelo de VED y el control sin transformar (Col-0). Mediante un ensayo de marcaje por proximidad (TurboID) con las variantes de PS y VED para Wf en N. benthamiana encontramos que Wf interacciona con una chaperona citosólica implicada en el transporte y ensamblaje de proteínas a la membrana externa del cloroplasto. A partir de esta información hemos elaborado un modelo de regulación molecular de la coloración de la pulpa del fruto del melón. Los frutos de melón son blancos durante los primeros estadios de desarrollo y presentan plastos con estructuras membranosas poco diferenciadas. En los melones de pulpa naranja, la variante CmOrHis induce la síntesis de carotenoides y la diferenciación de cromoplastos. En los frutos que carecen de la variante CmOrHis, los frutos maduros serán blancos o verdes dependiendo de la variante de Wf, cuya expresión se induce con los primeros cambios de color asociados a la diferenciación de amiloplastos (blancos) o cloroplastos (verdes). En los melones blancos, la variante activa PS-Wf actúa reprimiendo la acción de genes implicados en la síntesis de clorofilas y el desarrollo de cloroplastos. En los frutos de variedades verdes, la variante VED-Wf al no ser funcional es incapaz de reprimir estos genes, los cuales realizan su función e inducen al desarrollo de cloroplastos.

Fruit flesh color in melon can be white, green or orange, depending on the accumulation of chlorophylls and/or carotenoids. This character is determined by two genes: Green flesh (Gf) and White flesh (Wf), being Gf epistatic over Wf. While Gf is responsible of orange flesh color, Wf is the main determinant of white and green coloration, with white being dominant over green. The Gf gene, located on chromosome 9, is MELO3C005449, also known as ORANGE (CmOr). The dominant allele of Gf (CmOrHis) leads to [Beta]-carotene accumulation and, therefore, the orange fruit flesh color. Wf identity is still unknown, although several candidates have been proposed. Prior to our study, the white-fleshed melon variety Piel de Sapo (PS, gf gf / Wf Wf) and the orange-fleshed Vedrantais (VED, Gf Gf / wf wf) were crossed to generate a recombinant inbred line (RILs) collection, which allowed to identify a QTL on chromosome 8, called LUMQU8.1, associated with white and green flesh color. In the first part of this thesis, different approaches such as fine mapping of LUMQU8.1 and transient expression experiments in Nicotiana benthamiana of candidate genes present in the interval led to the identification of Wf. The generation and characterization of the Arabidopsis thaliana transgenic lines overexpressing the PS and VED alleles of Wf allowed us to determine that PS variant of Wf is involved in the repression of chlorophyll biosynthesis and chloroplast development, this line present a slower deetiolation and a large impact on photosynthesis-related genes expression compared to VED overexpressors and the untransformed control (Col-0). Using a proximity labeling assay (TurboID) with the PS and VED variants for Wf in N. benthamiana we found that Wf interacts with a cytosolic chaperone involved in protein transport and assembly to the chloroplast outer membrane. From this information we have developed a molecular regulation model of fruit flesh color in melon. During the first stages of development, melon fruits are white and have plastids with poorly differentiated membranous structures. In orange-fleshed melons, the CmOrHis variant induces carotenoid synthesis and chromoplast differentiation. In fruits lacking the CmOrHis variant, mature fruits will be white or green depending on the Wf variant, which expression is induced with first color changes associated with amyloplasts (white) or chloroplasts (green) differentiation. In white melons, the active variant of PS-Wf acts by repressing the action of genes involved in chlorophyll biosynthesis and chloroplast development. In green fruit varieties, VED-Wf variant, as it is non-functional, is unable to repress these genes, which carry out their function and induce the development of chloroplasts.