Targeting ZAP-70 protein kinase in T-cell lymphoproliferative malignancies

Abstract

La heterogeneïtat biològica i clínica en les neoplàsies de cèl·lules T presenta un repte significatiu per al desenvolupament de tractaments efectius, especialment donada la limitada eficàcia de la quimioteràpia basada en antraciclines com a primera línia. Sovint, aquestes neoplàsies mostren desregulació epigenètica i mutacions en les vies de senyalització del receptor de les cèl·lules T (TCR). No obstant això, la raresa d'aquestes mutacions ha dificultat el desenvolupament de teràpies dirigides, i són necessàries teràpies més precises i efectives. La proteïna quinasa associada a la cadena zeta 70 (ZAP-70), una proteïna quinasa de tirosina citoplasmàtica predominantment expressada a les cèl·lules T, juga un paper crucial en la senyalització del TCR proximal, una via essencial per a la supervivència i creixement de les cèl·lules T. Sorprenentment, s'ha detectat una expressió elevada de ZAP-70 en determinades neoplàsies de cèl·lules T, i s'ha demostrat que la inhibició genètica de ZAP-70 afecta la proliferació de les cèl·lules T malignes i indueix l'apoptosi. En conjunt, aquests resultats suggereixen un paper de ZAP-70 en la progressió de les neoplàsies de cèl·lules T. Per aquesta raó, vam fixar com a objectiu desenvolupar inhibidors farmacològics de ZAP-70 i avaluar el seu impacte en línies de cèl·lules T malignes. Després de la selecció in vitro del perfil d'inhibició de quinases de 27 inhibidors candidats de ZAP-70 contra 26 quinases, vam identificar dos potencials inhibidors de la quinasa ZAP-70 amb petites molècules, IQS117 i IQS141. Aquests compostos van demostrar una inhibició sòlida d'aproximadament el 90% de l'activitat de la quinasa ZAP-70 mantenint una activitat de quinases residual superior al 20% per a les altres quinases. Estudis in vitro realitzats posteriorment amb les línies cel·lulars OCI-Ly13.2, Jurkat i T8ML-1, que representen diferents subtipus de neoplàsies de cèl·lules T, van mostrar una inhibició dependent de la dosi tant de la proliferació com de la viabilitat, amb tendència de les línies cel·lulars a ser més sensibles a IQS117. A més, ambdós compostos van mostrar una inhibició dependent de la dosi de molècules clau de la senyalització del TCR a les línies cel·lulars Jurkat i OCI-Ly13.2, incloent-hi ZAP-70, LAT, SLP-76, PLC[Gamma]1 i ERK1/2. Notablement, a diferència de IQS141, IQS117 també va mostrar efectes inhibidors en AKT, cosa que podria contribuir a la seva major efectivitat en la disminució de la proliferació i la viabilitat cel·lular. Les nostres investigacions posteriors in vivo amb IQS117 i IQS141 en ratolins immunodeficients a una dosi de 300 mg/kg no van mostrar efectes de toxicitat aguda detectables amb les administracions oral i intraperitoneal. Una anàlisi farmacocinètica posterior a una dosi de 50 mg/kg va indicar una vida mitja prolongada per a ambdós inhibidors de ZAP-70 després de l'administració oral, establint aquesta via com la preferida per a l'avaluació farmacològica posterior en models de xenoinjert de línies de cèl·lules T malignes. Malgrat tot, els models de xenoinjert subcutani i intravenós de cèl·lules T malignes tractats amb IQS117 i IQS141 no van mostrar un impacte significatiu en el creixement dels tumors ni en la supervivència. A més, l'anàlisi del transcriptoma dels tumors subcutanis després d'un tractament de set dies amb IQS117 i IQS141 no va revelar canvis específics associats a la inhibició de ZAP-70, la qual cosa planteja preocupacions sobre l'administració d'aquests fàrmacs al lloc del tumor i requeriria una validació posterior. En resum, els nostres resultats destaquen el potencial de la inhibició de ZAP-70 com un enfocament terapèutic per a les neoplàsies de cèl·lules T, alhora que posen de manifest la necessitat crítica d'optimitzar l'administració de fàrmacs IQS117 i IQS141 al lloc del tumor.

La heterogeneidad biológica y clínica en las neoplasias linfoides de células T representa un desafío importante en el desarrollo de tratamientos efectivos, especialmente dada la limitada eficacia de la quimioterapia basada en antraciclinas de primera línea. Estas neoplasias a menudo muestran desregulación epigenética y mutaciones en las vías de señalización del receptor de células T (TCR). Sin embargo, la baja frecuencia de estas mutaciones ha obstaculizado el desarrollo de terapias dirigidas, lo que hace necesario buscar terapias más precisas y efectivas. La proteína quinasa 70 asociada a la cadena zeta (ZAP-70), una tirosina quinasa citoplasmática expresada predominantemente en células T, desempeña un papel crucial en la señalización proximal del TCR, una vía esencial para la supervivencia y crecimiento de las células T. Es relevante destacar que se ha detectado una expresión elevada de ZAP-70 en ciertos subtipos de neoplasias linfoides de células T, y que la supresión génica de ZAP-70 ha demostrado impactar la proliferación de células T malignas e inducir apoptosis. En conjunto, estos resultados sugieren un papel de la ZAP-70 en la progresión de las neoplasias de células T. Por tanto, nuestro objetivo fue desarrollar inhibidores farmacológicos de la actividad quinasa de ZAP-70 y evaluar su efecto en líneas de células T malignas. Tras evaluar in vitro el perfil de inhibición de la actividad quinasa de 27 inhibidores candidatos de ZAP-70 frente a 26 quinasas, identificamos dos prometedores inhibidores de la quinasa ZAP-70, IQS117 e IQS141. Estos compuestos demostraron una sólida inhibición de aproximadamente el 90% de la actividad quinasa de ZAP-70, manteniendo una actividad quinasa residual superior al 20% para las demás quinasas del panel evaluado. Estudios in vitro posteriores en las líneas celulares OCI-Ly13.2, Jurkat y T8ML-1, que representan subtipos distintos de neoplasias linfoides de células T, revelaron una inhibición dependiente de la dosis tanto de la proliferación como de la supervivencia celular, habiendo una tendencia de las líneas celulares a ser más sensibles a IQS117. Además, ambos compuestos inhibieron de manera dependiente de la dosis la fosforilación de moléculas clave en la señalización del TCR en las líneas Jurkat y OCI-Ly13.2, incluyendo ZAP-70, LAT, SLP-76, PLC[Gamma]1 y ERK1/2. Notablemente, a diferencia de IQS141, IQS117 también demostró efectos inhibidores sobre AKT, lo que podría contribuir a su mayor eficacia en la disminución de la proliferación y viabilidad celular. Nuestras posteriores investigaciones in vivo con IQS117 e IQS141 en ratones inmunodeficientes a una dosis de 300 mg/kg no demostraron efectos tóxicos agudos detectables mediante administración oral e intraperitoneal. El análisis farmacocinético a una dosis de 50 mg/kg demostró una vida media prolongada en plasma para ambos inhibidores de ZAP-70 tras la administración oral, estableciendo esta como la mejor ruta para la posterior evaluación farmacológica de los compuestos en modelos de xenoinjerto de líneas de células T malignas. No obstante, el tratamiento con IQS117 e IQS141 en modelos de xenoinjerto subcutáneo e intravenoso de células T malignas, no mostró un impacto significativo en el crecimiento tumoral o en la supervivencia de los animales. Además, en el análisis del transcriptoma de los tumores subcutáneos tras ser sometidos a una semana de tratamiento con IQS117 e IQS141, no se identificaron cambios significativos asociados a la inhibición de ZAP-70, lo que plantea posibles dificultades en la distribución de los compuestos al tumor y requiere una validación adicional. En resumen, nuestros resultados resaltan el potencial de la inhibición de ZAP-70 como un enfoque terapéutico prometedor para las neoplasias linfoides de células T, al tiempo que subrayan la necesidad de optimizar los mecanismos de distribución de IQS117 e IQS141 para llegar eficazmente al tumor.

The biological and clinical heterogeneity within T-cell malignancies presents a significant challenge in developing effective treatments, particularly given the limited efficacy of first-line anthracycline-based chemotherapy. These malignancies often exhibit epigenetic dysregulation and mutations in the T-cell receptor (TCR) signaling pathways. However, the rarity of these mutations has hindered the development of targeted therapies, necessitating more precise and effective therapies. Zeta-chain-associated protein kinase 70 (ZAP-70), a cytoplasmic tyrosine kinase predominantly expressed in T cells, plays a crucial role in proximal TCR signaling, an essential pathway for the survival and growth of T cells. Remarkably, heightened ZAP-70 expression has been detected in certain T-cell malignancies, and genetic ZAP-70 knockdown has been shown to impact malignant T-cell proliferation and induce apoptosis. Altogether, these results suggest a role of ZAP-70 in mediating T-cell malignancy progression. Consequently, we aimed to develop pharmacological ZAP-70 inhibitors and evaluated their effect on malignant T-cell lines. After the in vitro screening of the kinase inhibition profile of 27 ZAP-70 candidate inhibitors against 26 kinases, we identified two promising small-molecule ZAP-70 kinase inhibitors, IQS117 and IQS141. These compounds demonstrated robust inhibition of approximately 90% of ZAP-70 kinase activity with off-targets residual kinase activity remaining above 20%. Subsequent in vitro studies in OCI-Ly13.2, Jurkat and T8ML-1 cell lines, representing distinct T-cell malignancy subtypes, unveiled a dose-dependent inhibition of both proliferation and viability, with cell lines tending to being more sensitive to IQS117. Additionally, both compounds exhibited dose-dependent inhibition of key TCR signaling molecules in Jurkat and OCI-Ly13.2 cell lines, including ZAP-70, LAT, SLP-76, PLC[Gamma]1, and ERK1/2. Notably, unlike IQS141, IQS117 also demonstrated inhibitory effects on AKT, potentially contributing to its enhanced effectiveness on decreasing cell proliferation and viability. Our subsequent in vivo investigations with IQS117 and IQS141 in immunodeficient mice at a dose of 300 mg/kg, revealed no detectable acute toxicity effects through oral and intraperitoneal administration. Further pharmacokinetic analysis at a dose of 50 mg/kg indicated a prolonged half-life for both ZAP-70 inhibitors following oral administration, establishing this as the best route for subsequent pharmacological assessment in xenograft models of malignant T-cell lines. Nonetheless, subcutaneous and intravenous xenograft models of malignant T-cells treated with IQS117 and IQS141 displayed no significant impact on tumor growth or survival. Additionally, transcriptome analysis of subcutaneous tumors following a seven-day treatment with IQS117 and IQS141 did not reveal specific ZAP-70 inhibition-associated changes, raising concerns about the delivery of these drugs to the tumor site and would require further validation. Collectively, our results underscore the potential of ZAP-70 inhibition as a therapeutic approach for T-cell malignancies, while emphasizing the critical need for optimizing IQS117 and IQS141 drug delivery to the tumor site.