Caracterización funcional de una nueva familia de péptidos bioactivos derivados de filamentos intermedios y estudio de sus posibles aplicaciones en salud humana

Abstract

Aquest projecte va començar a partir de la troballa fortuïta per part del grup del Dr. Joan Verdaguer (Universitat de Lleida) d'un pèptid anomenat DIF-P, derivat de la periferina, que pertany a una gran família de pèptids derivats de filaments intermedis (FI). Aquests pèptids tenen activitat proinflamatòria i citotòxica (a concentracions majors de 50 [Mu]M) i presenten una seqüència core de 9 aminoàcids altament conservada en tots els FI. En aquest treball s'ha realitzat una caracterització exhaustiva de diverses activitats (hemolítica i antimicrobiana), a banda de les dues abans esmentades. Per obtenir una penetració i internalització cel·lular més gran a través de les membranes biològiques, als pèptids d'estudi se'ls van fer modificacions en el seu extrem carboxil-terminal, com l'addició de seqüències de 8 arginines (8R), fet que incrementa les seves activitats. Addicionalment, s'han anat superant diverses dificultats, com la baixa solubilitat d'alguns d'aquests pèptids en medis salins, que finalment es va poder resoldre mitjançant la conjugació amb el polímer Pluronic F-127 i el seu derivat carboxilat, una molècula que polimeritza formant micel·les (m) i incorpora els pèptids catiònics, solubilitzant-los, sense que s'observi pèrdua d'activitat. Alhora, s'ha descobert que un dels pèptids identificats, anomenat K18, ja que deriva del FI queratina 18, després de l'addició de les cues de 8R presenta una activitat hemolítica, citotòxica i antimicrobiana més gran que el pèptid inicialment descobert (DIF-P), de manera que el pèptid K18-8R és el que hem utilitzat majoritàriament en els nostres experiments. Així mateix, s'ha aprofundit en l'activitat proinflamatòria del K18-8R(m), i s'ha vist que aquesta és òptima a concentracions de 5 [Mu]M. També s'ha comprovat que, en cèl·lules del sistema immune innat, activa l'inflamasoma NLRP3 i indueix la producció d'IL-1 beta, un procés que s'inhibeix amb inhibidors específics d'aquest inflamasoma. D'altra banda, s'han realitzat estudis mecanístics mitjançant assaigs de microscòpia electrònica utilitzant bacteris, i s'ha observat que K18-8R(m) és capaç de produir trencaments a la membrana d'aquests. Per tal de corroborar aquest efecte, s'han dut a terme assaigs de microscòpia confocal o de fluorimetria utilitzant fluorocroms específics com Calbryte, els quals han confirmat que aquest pèptid provoca la sortida de Ca2+ intracel·lular, donant suport a la idea de que aquest pèptid provoca algun tipus de disrupció a les membranes cel·lulars, probablement a causa de la formació de porus o altres estructures. Per acabar, s'ha descobert una nova activitat del pèptid com a agent potenciador de la transducció (PT), una línia aplicable a estratègies de teràpia gènica ex vivo. Per tal d'estudiar aquesta activitat s'han realitzat una gran quantitat d'experiments de transducció gènica utilitzant vectors lentivirals pseudotipats amb la proteïna G del virus de l'estomatitis vesicular (VSV-G) i codificant per a una proteïna fluorescent (eGFP+), tant en línies cel·lulars murines i humanes, així com en cèl·lules primàries: en progenitors hematopoètics CD34+, cèl·lules T i NK humanes. Els resultats obtinguts amb el pèptid K18-8R(m) a concentracions d'entre 1 i 3 [Mu]M són altament prometedors, millorant la transducció fins a 8 vegades, depenent del tipus de cèl·lula diana i de les condicions experimentals utilitzades, i amb uns resultats superiors als obtinguts utilitzant el producte competidor que millor ha funcionat (LentiBoost), aprovat actualment per a ús clínic. En definitiva, s'ha descobert un nou PT anomenat K18-8R(m) que podria millorar la eficiència i especificitat de la modificació genètica, reduint les dosis necessàries de vectors i contribuint a la durabilitat i a l'èxit per a l'avenç de la teràpia gènica ex vivo i la seva eventual aplicació a una àmplia varietat de malalties.

Este proyecto comenzó a partir de un hallazgo fortuito por parte del grupo del Dr. Joan Verdaguer (Universitat de Lleida) de un péptido denominado DIF-P derivado de la periferina, que pertenece a una gran familia de péptidos derivados de filamentos intermedios (FI). Estos péptidos tienen actividad pro-inflamatoria y citotóxica (a concentraciones mayores a 50 µM) y presentan una secuencia core de 9 aminoácidos altamente conservada en todos los FI. En este trabajo se ha realizado una caracterización exhaustiva de diversas actividades (hemolítica y antimicrobiana), aparte de las dos antes citadas. Para obtener una mayor penetración e internalización celular a través de las membranas biológicas, a los péptidos de estudio se les realizaron modificaciones en su extremo carboxilo-terminal, como la adición de secuencias de 8 argininas (8R), lo que incrementa sus actividades. Adicionalmente, se han ido superando diversas dificultades, como la baja solubilidad de algunos de estos péptidos en medios salinos, que finalmente se pudo resolver mediante la conjugación con el polímero Pluronic F-127 y su derivado carboxilado, una molécula que polimeriza formando micelas (m) e incorpora a los péptidos catiónicos, solubilizándolos, sin que se observe pérdida de actividad. A su vez, se ha descubierto que uno de los péptidos identificados, denominado K18, porque deriva del FI queratina 18, tras la adición de las colas de 8R presenta una mayor actividad hemolítica, citotóxica y antimicrobiana que el inicialmente descubierto (DIF-P), por lo que el péptido K18-8R es el que hemos utilizado mayoritariamente en nuestros experimentos. Asimismo, se ha profundizado en la actividad pro-inflamatoria del K18-8R(m), y se ha visto que esta es óptima a concentraciones de 5 µM. También, se ha comprobado que, en células del sistema inmune innato, activa al inflamasoma NLRP3 e induce la producción de IL-1 beta, un proceso que se inhibe con inhibidores específicos de dicho inflamasoma. Por otro lado, se han realizado estudios mecanísticos mediante ensayos de microscopía electrónica usando bacterias, y se ha observado que K18-8R(m) es capaz de producir roturas en la membrana de estas. Para corroborar dicho efecto, se han realizado ensayos de microscopía confocal o fluorimetría utilizando fluorocromos específicos como Calbryte, confirmando que este péptido provoca la salida de Ca2+ intracelular, lo que da soporte a la idea de que provoca algún tipo de disrupción en las membranas celulares, probablemente debido a formación de poros u otras estructuras. Por último, se ha descubierto una nueva actividad del péptido como agente potenciador de la transducción (PT), una línea aplicable a estrategias de terapia génica ex vivo. Para estudiar dicha actividad, se han realizado una gran cantidad de experimentos de transducción génica utilizando vectores lentivirales pseudotipados con la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) y codificando para una proteína fluorescente (eGFP+), tanto en líneas celulares murinas y humanas, como primarias: en progenitores hematopoyéticos CD34+, células T y NK humanas. Los resultados obtenidos con el péptido K18-8R(m) a concentraciones de entre 1 y 3 µM son altamente prometedores, mejorando la transducción hasta 8 veces, dependiendo del tipo de célula diana y de las condiciones experimentales utilizadas, y con unos resultados superiores a los obtenidos utilizando el producto competidor que mejor ha funcionado (LentiBoost) que está actualmente aprobado para uso clínico. En definitiva, se ha descubierto un nuevo PT denominado K18-8R(m) que podría mejorar la eficiencia y la especificidad de la modificación genética, reduciendo las dosis necesarias de vectores y contribuyendo a la durabilidad y al éxito para el avance de la terapia génica ex vivo y su eventual aplicación en una amplia variedad de enfermedades.

This project started with a serendipitous discovery by the group of Dr. Joan Verdaguer (Universitat de Lleida) of a peptide called DIF-P derived from periferin, which belongs to a large family of intermediate filament (IF) derived peptides. These peptides have pro-inflammatory and cytotoxic activities (at concentrations higher than 50 [Mu]M) and present a core sequence of 9 amino acids that is highly conserved in all IFs. In this work, a comprehensive characterization of different activities (hemolytic and antimicrobial) was performed, in addition to the two mentioned above. In order to obtain a better cell penetration and internalization through biological membranes, the peptides studied underwent modifications at their carboxyl-terminal end, such as the addition of 8-arginine sequences (8R), which increases their activities. In addition, several difficulties were overcome, such as the low solubility of some of these peptides in saline media, which was finally solved by conjugation with the polymer Pluronic F-127 and its carboxylated derivative, a molecule that polymerizes forming micelles (m) and incorporates the cationic peptides, solubilizing them without any loss of activity. In turn, it was discovered that one of the identified peptides, called K18 because it is derived from FI keratin 18, after the addition of the 8R tails, shows greater hemolytic, cytotoxic and antimicrobial activity than the one initially discovered (DIF-P), so that the K18-8R peptide is the one we have mainly used in our experiments. Likewise, the pro-inflammatory activity of K18-8R(m) was further investigated and found to be optimal at concentrations of 5 [Mu]M. It has also been shown to activate the NLRP3 inflammasome in innate immune cells and to induce the production of IL-1beta, a process that is inhibited by specific inhibitors of this inflammasome. On the other hand, mechanistic studies have been carried out using electron microscopy assays on bacteria and it has been observed that K18-8R(m) is able to induce ruptures in the membrane of these bacteria. To corroborate this effect, confocal microscopy or fluorimetry assays using specific fluorochromes such as Calbryte have been performed, confirming that this peptide causes the outflow of intracellular Ca2+, supporting the idea that it causes some type of disruption in cell membranes, probably due to the formation of pores or other structures. Finally, a new activity of the peptide was discovered as a transduction-potentiating agent (PT), a line applicable to ex vivo gene therapy strategies. To study this activity, a large number of gene transduction experiments were performed using lentiviral vectors pseudotyped with the vesicular stomatitis virus G protein (VSV-G) and encoding a fluorescent protein (eGFP+) in both murine and human cell lines as well as primary cells: CD34+ hematopoietic progenitors, T cells and human NK cells. The results obtained with the K18-8R(m) peptide at concentrations between 1 and 3 [Mu]M are very promising, with up to an 8-fold increase in transduction, depending on the target cell type and experimental conditions used, and with results superior to those obtained with the best performing competitor product (LentiBoost) currently approved for clinical use. Finally, a new PT called K18-8R(m) has been discovered that could improve the efficiency and specificity of the genetic modification, reducing the doses required and contributing to the durability and success for the advancement of ex vivo gene therapy and its eventual vivo gene therapy and its eventual application in a wide variety of diseases.