Caracterització i autenticació de productes nutracèutics i aliments funcionals per mètodes cromatogràfics i índexs espectroscòpics amb tractament quimiomètric de les dades

Abstract

[cat] Els conceptes de nutracèutics i aliments funcionals sorgeixen de l’interès en conèixer i analitzar quines molècules de la nostra alimentació són beneficioses per a la salut, més enllà dels valors nutricionals que aporten i, d’aquesta manera, aprofitar les qualitats naturals de les substàncies que conformen els aliments per contribuir en el manteniment del benestar i en la millora de la salut de la població i així aconseguir reduir el consum de fàrmacs, especialment els que tenen més efectes secundaris, i dels antibiòtics. De tot el ventall de substàncies que es troben presents en les mostres analitzades, com les alimentàries (cúrcuma, curri, pebre vermell, xocolata, cafè, te, suc de fruites, vi, cervesa i cava) i preparats nutracèutics (càpsules d’extractes de nabiu, gerd, raïm, vinya i carxofa), aquesta tesis s’ha centrat en els compostos antioxidants, més concretament en els polifenols, principalment àcids fenòlics y flavonoides. L’extracció d’aquests compostos en les mostres s’ha dut a terme mitjançant l’extracció assistida per ultrasons (Ultrasound-Assisted Extraction, UAE), optimitzant diferents factors, com ara, la composició del dissolvent, temperatura i temps d’extracció. Per analitzar estadísticament la influència de cada factor i la interacció entre aquests, s’ha realitzat l’anàlisi de la variància (Analysis Of Variance, ANOVA) i, per escollir les condiciones òptimes d’extracció, la realització de disseny d’experiments (Design Of Experiments, DoE). La determinació d’aquests compostos s’ha dut a terme, per una banda, a través de cromatografia de líquids de alta eficàcia (High Performance Liquid Chromatography, HPLC), en les modalitats de fase inversa (Reversed-Phase, RP) i cromatografia de líquids d’interacció hidrofílica (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC) amb detecció d’absorció molecular UV-visible i fluorescència, optimitzant prèviament les condicions de separació dels compostos polifenòlics de les mostres; també amb detecció per espectrometria de masses d’alta i baixa resolució, High Resolution Mass Spectrometry (HRMS) i Low Resolution Mass Spectrometry (LRMS), utilitzant l’Orbitrap i el Quadrupole-linear Ion Trap (QTRAP). Per altra banda, s’han utilitzat mètodes espectrofotomètrics, consistint en els següents tres índexs: l’índex de proantocianidines (PACs) totals, basat en la reactivitat del 4-dimetilaminocinnamaldehid (DMAC) amb els diferents flavanols, utilitzat per la industria farmacèutica per a la detecció dels flavanols; també, els índexs de Folin-Ciocalteu (FC) i de la capacitat reductora global (Ferric Reducing Antioxidant Power, FRAP) per estimar la capacitat antioxidant de les mostres. S’han aplicat estratègies d’anàlisi dirigit (targeted o profiling) i no dirigit (untargeted o fingerprinting), en base al contingut d’aquestes mostres, per a posteriori, realitzar tractaments quimiomètrics per anàlisi de components principals (Principal Component Analysis, PCA) i anàlisi discriminant per mínims quadrats parcials (Partial Least Squares Discriminant Analysis, PLS-DA) a fi de caracteritzar i autentificar les mostres. A més, s’ha utilitzat el tractament de regressió per mínims quadrats parcials (Partial Least Squares, PLS) per correlacionar els perfils cromatogràfics de les mostres a 280 nm amb els valors de les capacitats antioxidants, FC i FRAP, i així comprovar si són bons indicadors de la capacitat antioxidant. Els resultats obtinguts en les tècniques cromatogràfiques, utilitzades tant en l’anàlisi de les mostres de cúrcuma i curri, com en les de preparats nutracèutics, han mostrat que per aconseguir una correcta caracterització, classificació i autenticació de les mostres analitzades, les tècniques RP-HPLC-UV i HILIC-HPLC són les més aconsellables, segons el seu contingut en curcuminoids o flavanols, respectivament. Pel que fa als mètodes espectrofotomètrics, el mètode del DMAC ofereix una elevada selectivitat pels flavanols, però amb diferències significatives en la sensibilitat segons l’anàlit, essent aconsellable el seu ús per fer una estimació del contingut flavanòlic en les mostres. Per altra banda, els índexs FC i FRAP són adients com a indicadors de la capacitat antioxidant de les mostres, essent l’índex FRAP el més recomanable a fins pràctics, i una bona alternativa a la determinació del contingut fenòlic global per HPLC.

[eng] The concepts of nutraceuticals and functional foods arise from the interest in knowing and analyzing which molecules of our food are beneficial for health, beyond the nutritional values they provide and, in this way, taking advantage of the natural qualities of the substances that make up foods to contribute to the maintenance of well-being and to improve the health of the population, and thus reduce the consumption of drugs, especially those that have the most side effects, and antibiotics. Of the range of substances present in the analyzed samples, such as food (turmeric, curry, paprika, chocolate, coffee, tea, fruit juice, wine, beer and sparkling wine) and nutraceutical preparations (capsules of blueberry extracts, raspberry, grape, vineyard and artichoke), this thesis has been focused on antioxidant compounds, more specifically on the polyphenols, principally phenolic acids and flavonoids. The extraction of these compounds in the samples has been carried out by Ultrasound-Assisted Extraction (UAE), optimizing different factors, such as the composition of the solvent, temperature, and extraction time. To statistically analyze the influence of each factor and the interaction between them, the Analysis of Variance (ANOVA) has been carried out and, to choose the optimal extraction conditions, the Design of Experiments (DoE). The determination of these compounds has been carried out, on the one hand, through High Performance Liquid Chromatography (HPLC) in Reversed-Phase (RP) and Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) modes with detection of UV-visible molecular absorption and fluorescence, previously optimizing the conditions for separating the polyphenolic compounds from the samples; also with detection by High Resolution Mass Spectrometry (HRMS) and Low Resolution Mass Spectrometry (LRMS), using the Orbitrap and the Quadrupole-linear Ion Trap (QTRAP). On the other hand, spectrophotometric methods used, consisting of the following three indices: the index of total proanthocyanidins (PACs), based on the reactivity of 4-dimethylaminocinnamaldehyde (DMAC) with the different flavanols, used by the pharmaceutical industry for the detection of flavanols; also, the indices of Folin-Ciocalteu (FC) and global reducing capacity (Ferric Reducing Antioxidant Power, FRAP) to estimate the antioxidant capacity of the samples. Targeted and untargeted analysis strategies have been applied, based on the content of these samples, to subsequently carry out chemometric treatments by Principal Component Analysis (PCA) and Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) to characterize and authenticate the samples. In addition, the Partial Least Squares (PLS) regression treatment has been used to correlate the chromatographic profiles of the samples at 280 nm with the values of the antioxidant capacities, FC and FRAP, and thus test if they are good indicators of antioxidant capacity. The results obtained in the chromatographic techniques, used both in the analysis of turmeric and curry samples, as well as nutraceutical preparations, have shown that to achieve a correct characterization, classification and authentication of the analyzed samples, the RP-HPLC-UV and HILIC-HPLC techniques are the most advisable, according to their content in curcuminoids or flavanols, respectively. As for the spectrophotometric methods, the DMAC method offers a high selectivity for flavanols, but with significant differences in sensitivity according to the analyte, being advisable to estimate the flavanol content in the samples. On the other hand, the FC and FRAP indices are suitable as indicators of the antioxidant capacity of the samples, being the FRAP index the most recommended for practical purposes, and a good alternative determine the global phenolic content by HPLC.