Enhancing recombinant adeno-associated virus (rAAV) production through cell and gene engineering

Abstract

La teràpia gènica representa una revolució dins les teràpies emergents, amb l'objectiu de corregir o contrarestar mutacions genètiques i les seves malalties associades a través de la introducció, modificació o supressió de gens específics en les cèl·lules d'un individu. Els virus adenoassociats recombinants (rAAVs) han sorgit com a vectors altament efectius per a aquesta finalitat, amb diverses teràpies basades en rAAVs ja aprovades per tractar malalties rares, augmentant la seva demanda en qualitat clínica. No obstant això, la complexitat dels mètodes de producció de rAAVs i la falta de processos de fabricació robustos incrementen els costos de les teràpies gèniques, restringint l'accés dels pacients a aquests tractaments i dificultant la seva aplicació en malalties més comunes. Per abordar aquests desafiaments, s'investiguen les limitacions en la producció de rAAVs i es proposen modificacions cel·lulars i genètiques per avançar en el desenvolupament de teràpies basades en rAAVs, especialment en rAAV9 i rAAV1. Aquesta anàlisi es divideix en dues parts principals. La primera part es centra en el desenvolupament d'estratègies d'optimització de la producció de rAAVs mitjançant l'expressió genètica transitòria (TGE). Encara que actualment la triple transfecció (TT) en cèl·lules HEK293 és una de les plataformes dominants per a la producció de rAAVs, la seva implementació presenta limitacions significatives, per aquest motiu, s'exploren mètodes alternatius per a la seva millora. En treballs anteriors, el mètode d'expressió genètica extesa (EGE) es va desenvolupar com una eina prometedora per millorar la producció de rAAVs, ja que permet superar la producció obtinguda pel mètode de TT, recollint els rAAVs en el medi extracel·lular, eliminant la necessitat de lisi cel·lular. Al Capítol u, el mètode de producció de rAAVs per TT es compara amb el mètode d'EGE a nivell molecular utilitzant proteòmica quantitativa. La comparació de l'expressió proteica diferencial i els processos moleculars de les cèl·lules HEK293 entre les dues metodologies de producció proporciona un anàlisi detallat sobre cada estat cel·lular, permetent identificar possibles limitacions que afectin el mètode TT de producció de rAAVs i possibles dianes per a l'enginyeria racional de línies cel·lulars. Al Capítol dos, s'utilitzen les dianes identificades per a l'enginyeria metabòlica de cèl·lules hoste, per millorar l'obtenció d'AAVs a la fracció extracel·lular. A més, s'estudia la suplementació del medi per mitigar els efectes negatius de l'alta densitat cel·lular sobre l'eficiència de transfecció. Al Capítol tres, s'estudia l'expressió del gen adenoviral E1A durant la producció de rAAVs en cèl·lules HEK293 com una possible limitació per a la producció de vectors virals. Es caracteritza la dinàmica d'expressió dels nivells d'E1A durant la producció de rAAVs i es proposen estratègies per preservar la seva expressió, millorant així la producció. La segona part, que comprèn els capítols quatre i cinc, se centra en explorar estratègies per a la prova de concepte d'un sistema d'expressió genètica estable (SGE) de producció de rAAVs, avaluant l'ús de diferents línies cel·lulars com a sistemes productors. Per això, s'empren tècniques d'enginyeria genètica per a l'expressió induïble basada en el sistema Tet-On, juntament amb l'eina de Disseny d'Experiments (DoE) per desenvolupar i optimitzar els mètodes de producció de rAAVs. Al Capítol quatre, s'explora un primer pas cap al mètode SGE basat en l'expressió del gen rep de forma induïble utilitzant una línia cel·lular que conté el gen adenoviral E1, com la cèl·lula HEK293. El Capítol cinc es centra en l'avaluació de línies cel·lulars alternatives per la producció de rAAVs. De forma global, els resultats presentats en aquesta tesi contribueixen al desenvolupament d'estratègies de producció de rAAVs més eficients i amb menors costos, utilitzant tant plataformes d'expressió genètica transitòria com de línies cel·lulars estables.

La terapia génica representa una revolución dentro de las terapias emergentes, con el objetivo de corregir o mitigar mutaciones genéticas y sus enfermedades relacionadas a través de la introducción, alteración o eliminación de genes específicos en las células de un individuo. Los virus adenoasociados recombinantes (rAAVs) han surgido como vectores altamente efectivos para esta finalidad, con varias terapias basadas en rAAVs ya aprobadas para tratar enfermedades raras, aumentando la demanda de rAAVs de calidad clínica. No obstante, la complejidad de los métodos de producción de rAAVs y la falta de procesos de fabricación robustos eleva los costos de las terapias génicas, restringiendo el acceso de los pacientes a estos tratamientos y dificultando su aplicación en enfermedades más comunes. Para abordar estos desafíos, se investigan las limitaciones en la producción de rAAVs y se proponen modificaciones celulares y genéticas para avanzar en el desarrollo de terapias basadas en rAAVs, especialmente en rAAV9 y rAAV1. Este análisis se divide en dos partes principales. La primera parte, se centra en el desarrollo de estrategias de optimización para mejorar la producción de rAAVs mediante la expresión génica transitoria (TGE). Aunque actualmente la triple transfección (TT) en células HEK293 es una de las plataformas dominantes para la producción de rAAVs, su implementación presenta limitaciones significativas, por ese motivo, se exploran métodos alternativos. En trabajos anteriores, el método de expresión génica extendida (EGE) se desarrolló como una herramienta prometedora para mejorar la producción de rAAVs, permitiendo superar la producción obtenida por el método de TT, recogiendo los rAAVs del medio extracelular, eliminando la necesidad de lisis celular. En el Capítulo uno, el método de producción de rAAVs por TT se compara con el método de EGE a nivel molecular empleando proteómica cuantitativa. La comparación de la expresión proteica diferencial y los procesos moleculares alterados entre las dos metodologías de producción de las células HEK293, proporciona un análisis detallado sobre cada estado celular, permitiendo identificar posibles limitaciones que afectan el método de producción por TT y dibujando posibles objetivos para la ingeniería racional de líneas celulares. En el Capítulo dos, se utilizan las dianas identificadas para mejorar la obtención de rAAVs en la fracción extracelular a través de ingeniería metabólica en las células huésped. Además, se estudia la suplementación del medio para mitigar los efectos negativos de la alta densidad celular sobre la eficiencia de transfección. En el Capítulo tres, se estudia la expresión del gen adenoviral E1A durante la producción de rAAVs en células HEK293 como una posible limitación para la producción de vectores virales. Se caracteriza la dinámica de expresión de los niveles de E1A durante la producción de rAAVs y se proponen estrategias para preservar su expresión, mejorando así la producción. La segunda parte, que comprende los capítulos cuatro y cinco, se centra en desarrollar estrategias hacia la prueba de concepto para un método de expresión génica estable (SGE) de producción de rAAVs, evaluando el uso de diferentes líneas celulares como sistemas productores. Para ello, se emplean técnicas de ingeniería génica para la expresión génica inducible basada en el sistema Tet-On, junto con la herramienta de Diseño de Experimentos (DoE). En el Capítulo cuatro, se explora la expresión del gen rep de forma inducible usando las células HEK293, que contienen el gen adenoviral E1. El Capítulo 5 se centra en la evaluación de líneas celulares alternativas para la producción de rAAVs. En general, los resultados presentados en esta tesis contribuyen al desarrollo de estrategias de producción de rAAVs más eficientes y con menores costos, utilizando tanto plataformas de expresión génica transitoria como de líneas celulares estables.

Gene therapy represents a transformative therapeutical innovation, aiming to correct or counteract genetic mutations and their associated pathologies by introducing, modifying, or suppressing specific genes within an individual's cells. In recent years, recombinant adeno-associated viruses (rAAVs) have emerged as one of the most promising vectors for gene therapy applications and several rAAV-based therapies have been approved, particularly for the treatment of orphan diseases, increasing the demand of clinical-grade rAAV material. However, the complexity of rAAV production methods and the lack of robust scale-up current manufacturing processes, limits the capacity to produce rAAVs at the volumes required for clinical applications in a cost-effective manner. Consequently, the high cost of these products limits patient access to gene therapies, hindering the transition to treatments for prevalent diseases. These challenges are addressed in this thesis by investigating the rAAV production bottlenecks and proposing cellular and genetic modifications to advance into the development of rAAV-based therapies, giving specific interest to rAAV9 and rAAV1. This is addressed in two main parts. The first part, comprising Chapters one, two and three, focuses on the development of optimization strategies to improve rAAV production through transient gene expression (TGE). Although triple transfection (TT) into HEK293 cells is one of the dominant rAAV production platform nowadays, its robust application is limited, and different approaches are explored to improve it. In previous work, the extended gene expression (EGE) method was developed as a promising tool to enhance rAAV production, by enabling the continuous harvest of the secreted rAAV fraction, outperforming the TT, thereby eliminating the need of cell lysis. In Chapter one, the conventional TT method is compared to the EGE approach of rAAV production at a molecular level using a proteomic quantitative approach. The comparison of differential protein expression and enriched molecular processes of HEK293 cells between the two production methodologies provides insights into each cellular state, allowing to identify putative bottlenecks affecting the TT method of rAAV production and potential targets for rational engineering of host mammalian cell lines. These targets are used for host cell metabolic engineering in Chapter two, to enhance the rAAV harvest in the supernatant fraction. Additionally, media supplementation feeds are developed to mitigate the impact of cell density on transfection efficiency, which typically declines at higher cell concentrations limiting rAAV production by the TT method at large scale. In Chapter three, the dynamics in adenoviral E1A gene expression in HEK293 cells during rAAV production is studied as a potential constrain for viral vector production. The E1A levels in a standard rAAV production system are characterized and different strategies to preserve its expression, thereby enhancing rAAV production, are proposed. The second part, comprising Chapters four and five, focuses on developing strategies towards the proof of concept for a stable gene expression (SGE) method of rAAV production, evaluating different cell lines as hosts. Gene engineering techniques for inducible gene expression based on the Tet-On system are employed alongside the Design of Experiments (DoE) tool to develop and optimize rAAV production methods. In Chapter four, a first step towards the SGE method using an adenoviral E1-containing cell line such as HEK293 is explored, based on a stepwise engineering approach for inducible rep gene expression. Chapter five is focused on the evaluation of alternative cell lines for rAAV production. Overall, the results presented in this thesis contribute to the development of more efficient and cost-effective rAAV production strategies, using both transient gene expression and stable cell line production platforms.