Ecology and processes of mercury detoxifying marine bacteria

Abstract

El mercuri (Hg) és un metall tòxic i estès a l'ambient. El monometilmercuri (MMHg) és un potent neurotòxic especialment preocupant a causa de la seva bioacumulació a les xarxes tròfiques aquàtiques. En els sistemes aquàtics, el MMHg es forma principalment als sediments per procariotes portadors dels gens hgcAB. La desmetilació de MMHg i la reducció de HgII també ocorren en sediments, realitzades per procariotes amb els gens mer. L'operó mer té dos enzims, MerA (HgII reductasa), que converteix HgII en Hg0, i MerB (organomercuri liasa), que és responsable de la degradació de MMHg a HgII. La metilació ha estat àmpliament estudiada des del descobriment dels gens hgcAB. En canvi, estudiar la desmetilació ambiental del MMHg ha estat molt difícil, per això els principals actors i els factors involucrats en la seva activitat segueixen sent bastant desconeguts. Al primer capítol de la tesi, vaig incubar sediments de la llacuna de Venècia per simular un esdeveniment de tancament de les barreres MOSE a l'estiu i la tardor, per determinar l'impacte de les barreres en la formació de MMHg. A l'estiu, vaig trobar un augment en la concentració de DOC (Carboni Orgànic Dissolt) i un enriquiment de substàncies protèiques i àcids húmics reactius, una concentració més gran de MMHg a l'aigua i majors taxes de metilació en els sediments incubats després de 48h. Tant les altes taxes de metilació com l'augment de les concentracions de MMHg podrien incrementar la bioacumulació a la llacuna. Aquests resultats són particularment preocupants en el context de canvi global en el qual la llacuna es tancarà més sovint durant períodes més prolongats degut a l’augment d'inundacions. A més, l'increment esperat de la temperatura podria augmentar les taxes de formació de MMHg i/o perllongar l'estació càlida durant la qual es forma MMHg. Al capítol 2, combinant dades metagenòmiques i metatranscriptòmiques de sediments, es dóna llum sobre l'ecologia i els trets funcionals dels procariotes que contenen merA i/o merB. Es va reconstruir la col·lecció MERCLUB-MAG (amb 803 MAG) i es van seleccionar els MAG que contenien merAB (45 MAG) per estudiar-ne l'abundància, l'activitat i les capacitats metabòliques. Les principals troballes són que i)merB era més freqüent i actiu que merA, ii)les Gammaproteobacteria eren el tàxon més predominant però hi havia una alta novetat taxonòmica i iii)els MAG que contenien merAB tenien metabolismes molt diversos. Paral·lelament es va obtenir la col·lecció de cultius MERCLUB amb la intenció de trobar el millor candidat per utilitzar en bioremediació. Inicialment, vaig triar 46 aïllats per a una avaluació fisiològica general i, després d'un procés de selecció, vaig determinar les taxes de creixement i eliminació de Hg de tres candidats finals: Aeromonas sp. MERCC_1069, Pseudomonas putida MERCC_1942 i Bacillus sp. MERCC_2852. Aeromonas sp. va ser eficient en cultius en batch, però finalment es va seleccionar Pseudomonas putida MERCC_1942 per optimitzar l'eliminació de Hg en cultiu continu. La soca MERCC_1942 cultivada a altes taxes de creixement presentava una major eficiència d'eliminació de mercuri i ha estat proposada per a finalitats de bioremediació. Finalment, vaig utilitzar Alteromonas mediterranea ISS312, que es distribueix global i verticalment als oceans, per estudiar els efectes del MMHg en el seu creixement i en l'expressió dels seus gens. Vaig seqüenciar el genoma i vaig caracteritzar els gens mer, mostrant que té 4 operons diferents. En segon lloc, comparant mostres suplementades amb 5 µM de MMHg amb mostres control, vaig observar una fase de latència més llarga i una expressió diferencial d'alguns gens mer. A més, els gens mer presentaven patrons de coexpressió molt diversos. Aquests resultats indiquen que aquesta soca bacteriana es pot utilitzar com a model per estudiar la desmetilació i la reducció del Hg.

El mercurio (Hg) es un metal tóxico y extendido. El monometilmercurio (MMHg) es un potente neurotóxico especialmente preocupante debido a su bioacumulación a través de las redes alimentarias acuáticas. En los sistemas acuáticos, el MMHg se forma principalmente en los sedimentos por procariotas que portan los genes hgcAB. La desmetilación de MMHg y la reducción de HgII también ocurren en sedimentos, realizadas por procariotas con los genes mer. El operón mer tiene dos enzimas, merA (HgII reductasa), que convierte HgII en Hg0, y merB (alquilmercurio liasa), que es responsable de la degradación de MMHg a HgII. La metilación se ha estudiado ampliamente desde el descubrimiento de los genes hgcAB en 2013. Sin embargo, estudiar la desmetilación ambiental del MMHg ha sido muy difícil, y los principales actores involucrados y los principales factores que controlan su actividad siguen siendo en gran medida desconocidos. En el primer capítulo, incubé sedimentos de la laguna de Venecia para simular un evento de cierre de MOSE en verano y otoño, y así determinar el impacto de las barreras en la formación de MMHg. En verano, encontré un aumento en la concentración de DOC y un enriquecimiento de sustancias proteicas y ácidos húmicos reactivos, una mayor concentración de MMHg en el agua y mayores tasas de metilación en los sedimentos incubados después de 48 h. Tanto las altas tasas de metilación como el aumento de las concentraciones de MMHg podrían incrementar la bioacumulación en la laguna. Estos resultados son particularmente preocupantes en el contexto de cambio global en el que la laguna se cerrará con mayor frecuencia durante períodos más prolongados debido al creciente número de inundaciones. Además, el aumento esperado de la temperatura podría aumentar las tasas de formación de MMHg y/o prolongar la estación cálida durante la cual se forma MMHg. En el capítulo 2, combinando datos metagenómicos y metatranscriptómicos de sedimentos, se arroja luz sobre la ecología y los rasgos funcionales de los procariotas que contienen merA y/o merB. Se reconstruyó la colección MERCLUB-MAG (con 803 MAG) y se extrajeron los MAG que contenían merAB (45 MAG) para estudiar su abundancia, actividad y capacidades metabólicas. Los principales hallazgos son que i)merB fue más frecuente y activo que merA, ii)las Gammaproteobacteria fueron el taxon más predominante pero hay una alta novedad taxonómica y iii)los MAG que contenían merAB tienen metabolismos muy diversos. Paralelamente se obtuvo la colección de cultivos MERCLUB con la intención de encontrar el mejor candidato para utilizar en biorremediación. Inicialmente, eligí 46 aislados para una evaluación fisiológica general y, tras un proceso de selección, evalué las tasas de crecimiento y de eliminación de Hg de tres candidatos finales: Aeromonas sp. MERCC_1069, Pseudomonas putida MERCC_1942 y Bacillus sp. MERCC_2852. Aeromonas sp. fue eficiente en cultivos discontinuos, aunque finalmente se seleccionó Pseudomonas putida MERCC_1942 para optimizar la eliminación de Hg en cultivo continuo. La cepa MERCC_1942 cultivada a altas tasas de crecimiento presentó la mayor eficiencia de eliminación y es propuesta para la biorremediación. Por último, utilicé Alteromonas mediterranea ISS312, que se distribuye global y verticalmente en los océanos, para estudiar los efectos del MMHg en su crecimiento y en la expresión de sus genes. Secuencié el genoma y caractericé los genes mer, mostrando que tiene 4 operones diferentes. En segundo lugar, comparando muestras suplementadas con 5 µM de MMHg con muestras control, observé una fase de latencia más larga y una expresión diferencial de algunos, pero no de todos, los genes mer. Además, los genes mer presentaron patrones de coexpresión muy diversos. Estos resultados indican que esta cepa bacteriana se puede utilizar como modelo para estudiar desmetilación y la reducción de Hg.

Mercury (Hg) is a toxic and widespread metal. Monomethylmercury (MMHg) is a potent neurotoxic and especially worrisome due to its bioaccumulation through the aquatic food webs. In aquatic systems, MMHg is form mainly in sediments by prokaryotes carrying the hgcAB genes. MMHg demethylation and HgII reduction can also take place in sediments, performed by prokaryotes containing the mer genes. Operon mer has two enzymes, merA (mercuric reductase) which converts HgII to Hg0, and merB (organomercurial lyase) which is responsible for the degradation of MMHg to HgII. Methylation has been extensively studied since the discovery of the hgcAB gene cluster in 2013. However, studying MMHg demethylation in the environment has been very difficult, thus the main players involved in this process and the main factors controlling their activity remain largely unknown. In the first chapter, I incubated sediments from the Venice Lagoon to simulate a MOSE closing event in two seasons, summer and autumn, and determine the impact of tide-regulating barriers in the formation of MMHg. In summer, I found an increase in the concentration of DOC and an enrichment of proteinaceous substances and reactive humic acids, a higher MMHg concentration in the water column and higher methylation rates in incubated sediment cores after 48h. Both higher methylation rates and increased MMHg concentrations could potentially enhance bioaccumulation in the lagoon’s biota. These results are especially worrisome in the context of global change in which the lagoon will closed more frequently for longer times due to the increasing number of flooding events. Moreover, the expected raise in temperature might increase MMHg formation rates and/or prolong the warmer season during which MMHg is formed in sediments. In Chapter 2, by combining metagenomic and metatranscriptomic data from sediments, my results shed light on the ecology and functional traits of the merA and/or merB containing prokaryotes. The MERCLUB-MAG Collection was reconstructed (with 803 MAGs) and the merAB containing MAGs were extracted (45 MAGs) to study their abundance, activity and metabolic capacities. The main findings are i) merB was more frequent and active than merA, ii) merAB containing MAGs had a high level of taxonomic novelty, although Gammaproteobacteria was the most predominant taxa and iii) the merAB containing MAGs had very diverse metabolisms. Parallelly, the MERCLUB Culture Collection was obtained with the intention of finding the best candidate to be used in bioremediation strategies. Initially, 46 isolates were chosen for general physiological assessment, and after a selection process, the growth rates and the Hg removal capacities of three final candidates – Aeromonas sp. MERCC_1069, Pseudomonas putida MERCC_1942 and Bacillus sp. MERCC_2852 were determined. Aeromonas sp. was highly efficient in batch cultures, although Pseudomonas putida MERCC_1942 was finally selected to be optimized using the continuous culture technique to achieve maximum Hg removal in the bioremediation process. Strain MERCC_1942 grown at high growth rates presented the highest removal efficiency and thus was the proposed candidate for bioremediation. Lastly, I used Alteromonas mediterranea ISS312, which is globally and vertically distributed throughout oceans, to study the effects of MMHg in its growth and in its gene’s expression. I sequence the genome and characterized the mer genes, showing that it has 4 different operons. Secondly, I performed a transcriptomic experiment in which I compared control (not amended) and samples amended with 5 uM of MMHg. In the amended cultures, I observed a longer lag phase in the growth curve, and differential expression of some but not all of the mer genes. Additionally, the mer genes presented very diverse co-expression patterns among them. These results indicate that this bacterial strain can be used as a model microorganism for MMHg demethylation and HgII reduction.